[发明专利]强化酶促合成异槲皮苷的方法

说明书

技术领域

本发明属于酶法合成食品添加剂领域，具体涉及一种超声波场致强化酶促合成异槲皮苷的方法。

二、背景技术

现有技术：异槲皮苷(Isoquercitrin)，即槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(Quercetin-3-glucose)，在自然界中非常罕见，是一种具有显著抗氧化性、抗肿瘤等生物活性的黄酮类高级食品添加剂和天然药物有效成分，也是近年来国际上新型功能性食品添加剂EMIQ(Enzymatically Modified Isoquercitrin)的合成原料(Toxicology，2010，268(3)：213-218)。

专利CN 101985639 A以自然界分布广泛、来源丰富的芦丁为原料，经糖苷酶催化水解反应制备异槲皮苷，建立了生物转化芦丁定向合成异槲皮苷的酶促水解工艺；酸水解制备异槲皮苷的水解温度较高，酸类催化剂对设备腐蚀严重，并产生大量的酸性废水，且芦丁的水解过程中槲皮素和异槲皮苷共存，必须对水解产物采用分离手段才能获得异槲皮苷(African Journal of Biotechnology，2011，10(8)：1460-1466)。在此基础上，酶促水解芦丁被公认是制备异槲皮苷最有前景的方法，其中a-L-鼠李糖苷酶催化的酶促芦丁定向水解反应是生产异槲皮苷的关键，也是提高酶法生产效率的重要途径。因此，提高a-L-鼠李糖苷酶酶促反应的速度和强度是提高异槲皮苷转化率、芦丁原料利用率和生产效率的关键技术之一。

大量的研究表明：超声波场致作用对酶的活性有影响，选择适宜的超声处理条件可提高酶促反应速度(Journal of Cleaner Production，2008，16(5)：591-597)。超声作用对于酶促反应的影响依赖于反应中酶的活性的变化，反应酶活力的表现必须依赖酶分子的构象。超声波场致作用提高酶活主要有两方面的原因：一方面超声波产生的微流效应可促进底物迅速进入酶的催化部位及产物进入介质，从而提高了酶的催化效率；另一方面，超声波的空化作用所产生的冲击波改变了酶分子的空间构象，从而改变了酶促反应的进程(Ultrasonics Sonochemistry，2011，18(1)：303-309)。超声波用于强化酶促反应份内源酶和外源酶两种类型：(1)作用于内源酶，如专利ZL 200610152149.7和CN101696435 A公开了超声强化内源蒜氨酸酶促反应和水相酶促反应连续制备大蒜风味物质的方法，有效提高了大蒜特征风味成分的产量；(2)作用于外源酶，如CN 101979642 A公开了超声波辅助纤维素酶解过程的方法，较大地提高了秸秆纤维素酶解后还原糖的转化率。

目前生物合成异槲皮苷目前尚未实现工业化大规模应用，原因在于传统以水为溶剂的反应体系中，芦丁等大多天然糖苷底物的溶解性差，且α-L-鼠李糖苷酶的催化效率较低。因此，本专利在酶促合成异槲皮苷过程中采用超声波场致强化，该方法操作简便，反应条件温和，产物得率高，对环境友好，从而可以克服传统糖苷酶催化合成效率较低和底物溶解度较低的缺点，易于工业化生产高纯度异槲皮苷，对推动其在医药、食品、化妆品等工业中的广泛应用具有十分重要的意义。

发明内容

技术问题：针对现有技术中所述的不足，本发明提供了一种超声波场致强化酶促合成异槲皮苷的方法。该方法在酶促合成异槲皮苷过程中采用超声波场致强化，可大大提高异槲皮苷的合成效率。

技术方案：

在10～150kHz范围内选定强度为不超过1.5w/cm²的超声波，1～60min/h连续作用于α-L-鼠李糖苷酶催化水解芦丁合成异槲皮苷的反应体系。以浓度为0.01～1mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，配制pH＝5～9的0.01～1g/L的芦丁母液。在芦丁母液中按体积比1～50％加入0.1～100g/Lα-L-鼠李糖苷酶液，在10～60℃、50～200r/min条件下振荡反应1～48h。反应结束后HPLC检测表明，超声波场致强化酶促合成产物异槲皮苷的转化率要高于在相同条件下但未经过超声强化的方法。

有益效果：

在酶促合成异槲皮苷的体系中采用超声波场致强化，异槲皮苷的产物得率比未经超声强化的方法高，因此超声波场致强化α-L-鼠李糖苷酶的酶促反应技术为异槲皮苷的生产提供了新的途径。该方法反应条件温和，对环境友好，易于工业化生产高纯度异槲皮苷。此外，整个酶促反应工艺基本上无废弃物产生，无环境污染，具有非常良好的工业化应用前景。

具体实施方式