[发明专利]人工优化合成的Epsps基因与重组载体以及改变作物抗性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人工优化合成的Epsps基因(即5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因)，含有该基因的重组载体，以及利用所述含有该基因的重组载体改变作物抗性的方法。

背景技术

草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型的除草剂，它能经济地防除几乎全部杂草，对人畜毒性很低，在土壤中易被微生物分解，残留低，是世界上产量最大、应用最广的除草剂。草甘膦毒性作用机理就是竞争性抑制莽草酸途径中催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸(S3P)合成5-烯醇式丙酮酰-3-磷酸莽草酸(EPSP)的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合成酶)，该合成酶是真菌、细菌、藻类、高等植物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成过程中一个关键性的酶。草甘膦专一性地抑制EPSP合成酶的活性导致分枝氨基酸合成受阻，阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，从而扰乱了生物体正常的氨基酸合成与氮代谢而使其死亡。

由于草甘膦是一种非选择性除草剂，所以在除去杂草的同时，也会杀死农作物。因此，通过基因工程技术开发抗草甘膦基因，获得草甘膦抗性农作物，对农业生产和草甘膦工业发展都有促进作用。目前，通过基因工程获得草甘膦抗性的策略主要有三个：一是修饰草甘膦作用的靶蛋白编码基因，使其表达的酶蛋白对草甘膦不敏感；二是促使相关酶过量表达，使植物吸收草甘膦后仍能正常代谢；三是引入草甘膦降解基因和酶系统，在草甘膦发生作用前将其降解。

自从Comai等(1983)从鼠伤寒沙门氏菌中分离出了抗草甘膦的突变基因aroA基因以来，许多研究者对抗草甘膦基因进行了研究。通过对来自细菌、真菌和植物的EPSP合成酶的序列比较，已经确定EPSP合成酶是除草剂草甘膦的作用靶标。目前发现的EPSP合成酶主要有两类。第一类是从鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)和大肠杆菌(Escherichia coli)中克隆得到的；第二类是从根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，无色杆菌(Achromobacter)，假单胞菌(Pseudomonas)，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)和金黄葡萄球菌(Staphylococccus aureus)中克隆的。第二类EPSP合成酶的氨基酸同源性相对保守，但第二类EPSP合成酶的酶动力学效率比第一类EPSP合成酶的高(王宏伟等，2007)。

很多E.coil及S.typhimrium的突变体中都含有编码EPSP合成酶的aroA基因。Comai等(1985)对S.typhimrium进行化学诱变，将突变发生在部分结构基因上的aroA基因转入大肠杆菌，获得了抗草甘膦的高效表达。这说明突变的抗除草剂基因可以在很大程度上提高细菌或者植物对草甘膦的抗性能力。何鸣等(2002)利用E.coil及S.typhimrium的EPSP合成酶基因的重组，获得突变的Epsps(aroAM12)基因。研究结果表明aroAM12基因在植物基因转化中，既可以用作抗除草剂基因，又可以代替常用的抗生素标记，用作植物筛选标记基因。

据美国孟山都公司的专利报道，在几种天然抗草甘膦细菌(根癌农杆菌CP4、无色杆菌LBAA、假单胞菌PG 2982等)中分离克隆到了抗草甘膦的EPSP合成酶。这类酶表现出了对草甘膦的高抗性和对底物(PEP)的高亲和力(Padgette et al.，1995)，不论草甘膦存在与否都有相似的催化特性。此类抗草甘膦基因已被应用于商品化转基因作物的生产中，如抗草甘膦转基因大豆，玉米，棉花以及油菜等，其中以孟山都公司为主。Ye等(2001)通过质体转化技术将无色杆菌、农杆菌、枯草杆菌的Epsps基因导入烟草中，在烟草的营养组织和生殖器官中都获得高水平的草甘膦抗性，虽然在营养组织和生殖器官中EPSPS的积累量不同导致在二者对草甘膦的抗性不同。

获得的抗草甘膦植物喷洒草甘膦后，由于抗草甘膦的EPSP合成酶继续起作用，提供植物所需的芳香族氨基酸，故而不受影响。但EPSP合成酶常表现出与其底物PEP的结合能力降低的情况，只有农杆菌中分离的EPSP合成酶不仅活性高，而且紧密地与其底物PEP结合。姚姝等(2006)分别将来源于大肠杆菌的aroA基因和农杆菌Epsps基因转入拟南芥，试验结果表明转Epsps基因的拟南芥植株比转aroA基因拟南芥植株对草甘膦具有更高的抗性。

发明内容