[发明专利]双齿围沙蚕金属结合蛋白基因的克隆方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种双齿围沙蚕金属结合蛋白（MPⅡ）基因的克隆方法。

背景技术

多毛类隶属于环节动物门，是广泛分布于海洋近岸和河口潮滩的优势底栖动物，也是海洋生态系统能量流动和物质循环的重要环节。由于其具有体型大、生命周期长、行动缓慢、分布广泛，对许多持久性污染物具有较强的耐受性和生物利用性，因此一直作为海洋沉积环境污染评价的指示生物和毒理研究的模型动物。如Bryan等发现杂色沙蚕(Nereis diversicolor)暴露于Cd²⁺192?h LC₅₀达到100?mg/L，远超过一般海洋无脊椎动物的耐受范围（0.1～10?mg/L）。有研究表明，在沉积环境中，杂色沙蚕对锌和镉的耐受浓度分别可达到100～3000?μg/g和0.2～9.3?μg/g，体内蓄积量亦可分别达到130～350?μg/g和 0.08～3.6?μg/g。

许多资料证实，几乎所有脊椎动物和大多数无脊椎动物，经重金属诱导后均能合成大量金属硫蛋白，参与细胞内金属水平的稳态调节、重金属解毒以及清除自由基等生物学功能。多毛类杂色沙蚕暴露于镉后可形成金属结合蛋白，分析表明，其是类似于血红蛋白(hemerythrin, Hr)或肌红蛋白(myohemerythrin, Mhr)家族的呼吸蛋白，称为MPⅡ，主要承担长期慢性重金属暴露条件下的解毒作用，研究表明金属结合蛋白不仅能够与镉相结合，还具有与锌和铜结合的能力，具有明显的抗菌活性。

双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis)在辽东湾潮间带底栖生物中为优势种，其金属结合蛋白（MPⅡ）基因序列在GenBank数据库中已有记载，该基因cDNA的序列全长904个碱基，其中阅读框为357个碱基，编码119个氨基酸，3’端非翻译区为463个碱基，5’端非翻译区有81个碱基。所记载的序列如下：

1   ccaactgagt ttaatcacta acttgagaaa gcaattttaa ctttgtgact cgagttcagc

61  gcagctcagc acaccttcaa gatgggttac gatattcctg aaccattcaa gtgggacgag

121 tccttcaagg tcttctatga catgctcgat gatgagcaca agcagatctt caacgccatc

181 ttcgatgtct gcggtggaaa caacgctaac aacctcaaga agatgatcga agttactgcc

241 aaccacttca aggatgagga gggcatgatg gtctctgcca agtatgccga cttcgactcc

301 cacaagaaga agcacgagga cttcttggcc gtcatccgtg gcctctctgc tcccgtcccc

361 gacgacaaga tcaagtacgc caaggaatgg ctcgtcaacc acatcaaggg aaccgacttc

421 cagtacaagg gcaagttgta aacagcgcgc catgacgcaa agtgccacct agctgttagt

481 gtcgtttcag cgggcgagag tgacgctcct ggtggtcaac agcaaaacta cgtgtcgttg

541 tgtgcaaaat gaatgactgt ccctgttagt cagttgtcgt caccctacgc agcgttttct

601 acacctggca gcttcgtgtt aatttctcag ccgattagta ttaagaactt gccaagatta

661 tgagcaaaaa ctactcgcag aaaaactcat caaaattcac ggacagtttc cttaagatca

721 gacaaaataa gatcattata aacaggacct taacatctgg tgtcctttgt cacacttaag

781 gtattatttc tctcgtcaat cacatcctaa caatgcaatg tatatattct acattgatta

841 attttggaat ttgtgaatct tgtgtgttac attttaataa actctgcttt tctaaaaaaa