[发明专利]一种牛血清白蛋白非标记质谱定性、定量检测方法

权利要求书

1.一种牛血清白蛋白非标记质谱定性、定量检测方法，其特征在于，步骤如下：(1)蛋白的酶解：将50μg待检测的蛋白样品溶于8.34μL含有尿素、DTT和NH₄HC0₃的水溶液中，置于37℃水浴中还原4h，然后加入0.84μL碘乙酰胺溶液，放置暗处1h，再加58.34μL NH₄HCO₃溶液，最后加入1μg胰蛋白酶，37℃保温反应16h，反应结束后，冷冻干燥成粉末备用；

所述含有尿素、DTT和NH₄HCO₃的水溶液中，含有尿素、DTT和NH₄HCO₃的水溶液中，尿素的浓度为8M，DTT的浓度为10mM，NH₄HCO₃的浓度为50mM；

所述碘乙酰胺溶液中碘乙酰胺的浓度为0.5M；

所述NH₄HCO₃溶液的浓度为50mM；

(2)液相色谱检测：对上述蛋白的酶解产物进行液相色谱检测，蛋白酶解产物的进样量不低于100ng，液相的梯度条件为：0-5min，B相保持5％；5-45min，B相从5％升至45％；45-50min，B相从45％升至95％；50-55min，B相从95％降至5％，柱后平衡10min；流速为0.2-0.6mL/min；

(3)定性检测：定性检测的肽段为：HLVDEPQNLIK，检测蛋白的酶解产物中是否含有该肽段，若有，则证明待检测的蛋白样品为牛血清白蛋白，若没有，则证明待检测的蛋白样品不是牛血清白蛋白；

(4)定量检测：定量检测的肽段为：ATEEQLK，检测蛋白的酶解产物中该肽段的浓度，通过以下公式计算得出牛血清白蛋白的浓度：在蛋白浓度为10μg/mL-500μg/mL的线性范围内，该肽段的浓度与丰度线性方程为：y＝51925x-491814，R₂＝0.9991，其中，x：牛血清白蛋白的浓度，y：肽段ATEEQLK的丰度。

2.根据权利要求1所述的一种牛血清白蛋白非标记质谱定性、定量检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中，选用Agilent-1200色谱系统，流动相A为含0.1％甲酸的水溶液，B为含0.1％甲酸的乙腈溶液；分析柱为Agilent Poroshell 120SB-C18色谱柱，规格为3.0mm×150mm，粒径2.7μm。

3.根据权利要求1所述的一种牛血清白蛋白非标记质谱定性、定量检测方法，其特征在于：所述步骤(3)、(4)中，检测肽段所用的质谱条件为：离子源：ESI源，采用正离子模式检测，四极杆温度：100℃，毛细管电压：4000 V,雾化压力：40psig，Fragmentor：175V，干燥气温度：350℃，干燥气流速：10L/min，扫描模式：Scan，质量扫描范围200-2000m/z。

4.根据权利要求1所述的一种牛血清白蛋白非标记质谱定性、定量检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中，流速为0.2mL/min。