[发明专利]一种用于反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测领域，涉及一种用于反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照，更具体而言涉及一种用于反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物及其制备方法。

背景技术

反转录聚合酶链式反应试剂盒的对照样品在实验中的作用是：在每次RT-PCR检测时，设立的阴性对照样品和阳性对照样品是不能缺少的，阴性对照样品检测为阴性时，表明试验全部过程的试剂没有受到污染；阳性对照样品检测为阳性时，表明RNA提取、RNA反转录、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常。在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果都成立的前提下，才能对检测样品进行判定。因此，每次试验都应设立RNA提取、RNA反转录、DNA扩增和电泳鉴定对照，只有设立试验全程的对照，才能证明试验结果成立。因此，反转录聚合酶链式反应试剂盒要设立阳性对照，试剂盒中阳性对照需要满足以下三点：1)稳定性好，2)可靠有效，3)符合生物安全。

生物安全是指生物性的传染媒介通过直接感染或间接破坏环境而导致对人类、动物或者植物的真实或者潜在的危险。因此，符合生物安全是指避免了上述危险。所述危险例如是高致病性病原微生物，第一类和第二类病原微生物统称为高致病性病原微生物，第一类病原微生物，是指能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。第二类病原微生物，是指能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。对于一些高致病性病原微生物的反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照，目前大多数这种试剂盒做法是将目的片段克隆至载体上，其缺点是不能作为RNA提取、RNA反转录过程对照，且容易污染。

因此，亟需一种稳定性好、可靠有效、符合生物安全的反转录聚合酶链式反应试剂盒阳性对照的制备方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性组合物对照，特别是阳性对照组合物及其制备方法，该方法制得的阳性对照稳定性好、安全可靠、可大大减少试验污染的可能性。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的。本发明提供了一种反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物的制备方法，其特征在于，选取一种非靶病毒作为阳性对照模板。

本发明的一个方面，反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物的制备方法中选取的非靶病毒为RNA病毒，其可以是任意的符合生物安全的RNA病毒，包括但不限于鸡新城疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒，并且选自比较安全、遗传稳定、容易培养的病毒株。

在本发明的具体实施方式中，所选取的非靶病毒株鸡新城疫病毒lasota株和猪繁殖与呼吸综合征病毒MLV株。

本发明的还一个方面，反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物的制备方法中还包括使用灭活试剂处理所述非靶病毒的培养液。所述灭活试剂为高浓度强变性剂，其迅速破坏细胞结构，使RNA从细胞中释放出来，还使细胞内的RNA酶失活，使释放出的RNA不被降解。其中，高浓度强变性剂包括但不限于异硫氰酸胍、硫氰酸胍、盐酸胍等含有胍基的盐。灭活试剂可用于RT-PCR、实时荧光RT-PCR阳性对照的灭活。也就是说，在本发明所述的方法中将非靶病毒培养液用变性剂进行稀释，稀释的倍数可由本领域技术人员容易地确定，一般应稀释不小于7倍，优选地稀释50-100倍，更优选地稀释50倍。稀释倍数与病毒含量有关，其中阳性对照的要求是病毒含量既不能太高，也不能太低；太高了，容易污染试剂盒，太低了，使试剂盒的保存期较短。根据各自试剂盒的要求进行稀释。

本发明的还一个方面，反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物的制备方法中还包括设计一对非靶病毒引物，对所述选取的非靶病毒进行扩增，扩增的片段长度与反转录聚合酶链式反应试剂盒所针对目的基因的长度相同

本发明还提供了一种用于反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物，其特征在于包括一种非靶病毒作为阳性对照模板。

在本发明的具体实施方式中，阳性对照组合物中选取的非靶病毒为RNA病毒，其可以是任意的符合生物安全的RNA病毒，包括但不限于鸡新城疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒，并且选自安全、遗传稳定、容易培养的病毒株，优选的所述病毒株包括鸡新城疫病毒lasota株和猪繁殖与呼吸综合征病毒MLV株。