[发明专利]一种利用葡萄糖和甘油混合碳源发酵生产ε-聚赖氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用葡萄糖和甘油混合碳源发酵生产ε-聚赖氨酸的方法，具体地说是指通过pH值控制和流加发酵的方法，利用葡萄糖和甘油共同作碳源高效发酵生产ε-聚赖氨酸，属于发酵工程领域。 

背景技术

ε-聚赖氨酸(ε-PL)一般是由25～35个L-赖氨酸的α-COOH和ε-NH2相互缩合而形成的L-赖氨酸聚合物，分子量在3500～4500Da。ε-PL只能由微生物合成，且ε-PL产生菌仅分布于链霉菌属和北里孢菌属。目前，ε-PL主要作为食品防腐剂，广泛用于淀粉质类食品防腐。ε-PL作为一种新型食品防腐剂，相比于传统化学防腐剂和生物防腐剂，具有更广的抑菌谱(有效抑制G+、G-、酵母菌和霉菌等)、更好的水溶性、更强的热稳定性(100℃，30min或120℃，20min)和更广的pH适用范围(等电点为pH9.0左右)等；同时，ε-PL的添加不会影响食品风味。更为重要的是，ε-PL具有较高的安全性：ADME(Absorption，Distribution，Metabolism and Excretion)实验证实ε-PL很难被生物体的肠胃吸收且急性口服剂量达5g/kg。因此，ε-PL是一种安全、高效的新型生物防腐剂。事实上，ε-PL早在1980s即被日本允许作为食品防腐剂使用；随后，韩国也批准ε-PL在食品中添加；2003年，ε-PL获得美国FDA认证(GRN000135)，并开始进入美国和欧洲市场。另外，ε-PL作为高分子聚合物前体，具有较高的生物相容性和特异阳离子性，被广泛用作生物可降解材料、乳化剂、高吸收性水凝胶、药物载体、抗癌增进剂和生物芯片外被等领域研究和应用。因此，ε-PL具有广阔的市场应用前景。然而，国际上只有日本窒素公司(Chisso Corporation)实现了ε-PL工业化发酵生产且已形成年产千吨级的规模。ε-PL在国内的研究，大多处在实验室和中试开发阶段且发酵水平较日本差距较大。所以，建立ε-PL高效发酵工艺提高ε-PL发酵产量和生产强度，对于建立我国ε-PL产业具有重要意义。 

葡萄糖是发酵生产ε-PL普遍采用的碳源。岩田敏治等人(CN 1260004A)利用改造后的小白链霉菌lysinopolymerus亚种11011A-1(FERM BP-1109)转化葡萄糖合成大量ε-PL。徐虹等人(CN 101509021A)利用细胞固定化方法培养北里孢菌PL6-3，以葡萄糖作碳源发酵生产ε-PL。贾士儒等人(CN 101671703A)利用葡萄糖作碳源并流加L-赖氨酸发酵生产ε-PL。虽然ε-PL产生菌能够快速利用葡萄糖合成菌体和ε-PL，但ε-PL产量和底物转化率不高，并且在补料阶段由于葡萄糖溶解度以及流加方式的限制，会引起发酵液稀释并导致ε-PL浓度降低，从而增加了后提取成本和废水处理负荷，最终引起ε-PL生产成本的增加。 

最近，我们提出了利用工业甘油作碳源发酵生产ε-PL的方法(201110250123.7)。该方法与以葡萄糖作碳源相比，尽管显著提高了ε-PL发酵产量和底物转化率，但发酵时间较长，从而导致生产强度较低。 

葡萄糖和甘油都是ε-PL产生菌最适碳源(Shima S，Sakai H.Agric Biol Chem 1981，45：2497-2502)。以葡萄糖为唯一碳源时，ε-PL产生菌的发酵速度快，但ε-PL产量低，葡萄糖转化率低。以甘油为唯一碳源时，转化率高，ε-PL产量高，但发酵速度慢。然而，我们研究发现简单的将葡萄糖和甘油混合共同作为碳源用于ε-PL发酵却并不能有效提高ε-PL发酵水平。其关键在于，如何确定最合适的葡萄糖和甘油混合比例？如何保证发酵中后期的葡萄糖和甘油比例维持在最佳水平以及如何控制发酵过程合适pH值？基于此，本发明在考察了葡萄糖和甘油混合比例的基础上，结合葡萄糖和甘油流加策略保持发酵中后期总碳源浓度维持在较低水平的方法以及pH值控制策略，建立了一种利用葡萄糖和甘油混合碳源发酵生产ε-聚赖氨酸的方法。 

发明内容

本发明的主要目的是提供一种利用葡萄糖和甘油混合碳源发酵生产ε-聚赖氨酸的方法，提高ε-PL发酵产量和生产强度，从而降低生产成本。 

本发明采用的技术方案如下： 

利用ε-PL产生菌培养20～30h的种子液，接种葡萄糖和甘油混合碳源的培养基，在初始pH 6.5～7.0、温度为28～32℃、溶氧保持在15～40％的培养条件下，采用pH值调控策略和流加发酵方法生产ε-PL。