[发明专利]哺乳动物细胞大规模生产重组可溶性人干细胞因子与免疫球蛋白Fc片段融合蛋白(sSCF-Fc)的实验技术

说明书

技术领域

本发明涉及一种将人干细胞因子与人免疫球蛋白IgGl的Fc段融合基因(sSCF-Fc)转入哺乳动物细胞以大规模生产其蛋白产物的技术。

背景技术

1.SCF的生物学作用与应用前景

干细胞因子(stem cell factor，SCF)，又称KIT配体(KIT Ligand，KITLG)或肥大细胞生长因子(Mast cell growth factor，MGF)，是一种与原癌基因c-Kit产物结合的糖蛋白(CD117)。SCF通过可变剪切可以形成跨膜型和可溶性两种形式的的蛋白产物，二者都具有生物活性，在机体发育、肿瘤发生、发展和侵润及其它疾病的形成等过程中发挥重要的作用。

SCF对于胚胎发育过程中的造血作用至关重要。SCF指导造血干细胞进入造血微环境，并维持造血干细胞的存活能力和再生能力。可溶性或细胞表面的SCF通过与其细胞表面受体c-Kit结合影响效应的肥大细胞、造血前体细胞、生殖细胞和黑素细胞的分化和功能。所有血管发生的组织如骨髓、胎肝等都有SCF表达。有研究显示，SCF或其受体表达缺陷能够引起巨红细胞贫血症甚至死亡。

SCF在精子发生过程中也扮演重要角色。SCF是精巢形成和发育的关键性调节分子，其与受体结合激活的信号通路对于生殖细胞的增殖、迁移、减数分裂及其凋亡都发挥着重要的调节作用。SCF表达的时间和区域与生殖细胞的形成及迁移的路径一致，其受体的表达时相也与生殖细胞的形成过程具有同一性。SCF系统对人生精细胞的调控不仅限于胚胎期，在青春期及随后精子发生的全过程均以不同的方式发挥调控作用。SCF及其受体缺失能够引起不育症。

SCF对于在发育过程中黑素细胞的定位非常重要。机体的色素沉着由一类能够产生黑色素的黑素细胞控制。SCF通过结合成黑素细胞表面的Kit受体指导其从中枢神经系统到达皮肤或毛发特定区域分化成黑素细胞。另外，SCF对于成体中终末分化的黑素细胞存活和增殖的调节同样重要。SCF表缺陷能够引起斑驳病。

SCF表达异常还与某些肿瘤的关系密切。与正常的肝组织相比，肝癌组织中SCF及c-Kit蛋白的表达明显降低；食管癌患者胃食管吻合术后，其胃粘膜和残存食管中SCF表达水平较正常人明显降低；胆管癌病人体内SCF表达水平和阳性率显著提高，且其表达与肿瘤分级呈正相关，SCF表达可能与胆管癌的发生密切相关，并且参与了肿瘤的侵润过程。目前，SCF已经用于某些疾病的治疗。SCF作为相关肿瘤的重要检测指标用于早期的诊断或预后的评价；另外，SCF还可作为肿瘤治疗上的新靶点，对于阻断肿瘤细胞向周围组织的扩散转移或肿瘤的复发可能有重要意义。

另外，体外造血干细胞或其他多能干细胞的大规模培养的成功为器官移植提供了可能性。SCF是在干细胞培养过程中不可或缺的细胞因子，用SCF与其它细胞因子(如IL-3，IL-6，IL-1，TPO，GM-CSF等)协同作用可体外扩增骨髓或外周血来源的干细胞，如造血干细胞、内皮祖细胞、神经干细胞，间充质干细胞等，这些干细胞直接回输至病人体内，或体外诱导其进行组织分化，将诱导形成的器官移植到病人体内，用于白血病、肿瘤或大面积创面的治疗。

目前，SCF还在其它疾病的治疗过程中发挥作用。SCF与其它化疗药物协同作用白血病患者可提高造血前体细胞的动员；SCF可用于降低非小细胞肺癌和乳癌化疗过程中产生的血小板减少症。制备高活性、高纯度、低毒性的重组SCF蛋白是生产临床诊断试剂、治疗用SCF药物和器官移植的前提，为其在科研、临床诊断和治疗等方面研究和应用提供了更多的可能性和广阔的市场前景。

2.Fc融合蛋白的表达

免疫球蛋白IgG的Fc融合蛋白是指在基因水平将目的基因同IgG的Fc片段基因相连而表达的重组蛋白，同时具有目的蛋白及免疫球蛋白的结构域，从而赋予了重组蛋白许多新的特性，拓展了蛋白在科研、制药及临床等方面的应用。

在重组蛋白表达的过程中，Fc重组蛋白易于结合Protein A，从而简化了蛋白的纯化过程；Fc片段可以方便地进行流式、免疫组化和免疫共沉淀等方法检测，可用于感兴趣的基因研究；体外实验中，Fc融合蛋白可用于拮抗或激活细胞表面受体用来研究受体-配体反应和信号通路；此外，Fc重组蛋白还能应用于噬菌体展示技术，如作为抗原制备人类全抗体库。