[发明专利]一种非病毒型转染试剂、其与质粒DNA复合物制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种非病毒型转染载体及其与质粒DNA复合物制备方案及其应用的技术。

背景技术

1.常规的转染方法

转染(transfection)是一种将外源基因导入真核细胞的技术，在蛋白结构和定位、基因功能和组分研究、基因表达调控和基因治疗等方面应用广泛，已成为生物学领域的重要工具。转染大致可通过物理、化学和生物三类方式介导。常见的物理介导方法有电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导的方法很多，如脂质体转染、磷酸钙共沉淀法、和阳离子物质介导的方法；生物介导方法目前最为常见的是各种病毒介导的转染方法。将病毒作为载体用于转染，其转染效率高，稳定性好，细胞毒性低，通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中易于形成稳定表达的细胞系，在很多实验中成为优先选择的方案。但是，病毒转染方法的程序复杂，在药物性哺乳动物重组蛋白表达或基因治疗等临床应用中，病毒载体还存在着潜在的安全隐患，而且随着蛋白表达规模的扩大，大量病毒载体的的使用必然导致生产成本的提高。开发一种安全、有效而便宜的转染载体对于大规模蛋白生产及临床治疗性转染的优化势在必行。

聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子聚合物，每相隔二个碳原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)。这种聚阳离子能将目的基因转入多种宿主细胞，而且其细胞毒性低，无潜在的生物危害性，弥补了病毒载体的不足。目前在转染用载体的设计中，经常将其做为核心部分。作为转染载体与病毒载体相比，PEI还存在转染效率不高和对细胞毒性大的问题，不利于后续研究或者生产过程的开展。

磷酸钙共沉淀法是另一种常用的转染方法。磷酸钙在特定pH值下形成沉淀时，DNA可与之一起沉淀；DNA附在细胞表面，通过胞吞作用或细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞。磷酸钙方法操作简单，价格便宜，是很多实验室首选的转染方法。但磷酸钙共沉淀法与病毒载体或脂质体等方案相比转染效率不高，且有很强的细胞依赖性。

本发明将PEI和磷酸钙共沉淀的方法结合，降低PEI试剂的用量，并对磷酸钙共沉淀的方案进行了改进，提供了一种非病毒型转染载体及其转染方案，为哺乳动物的大规模蛋白生产和基因治疗提供一种简便、有效而价格低廉的基因导入途径。

发明内容

本发明一个目的是提供一种转染试剂及其制备方法。将PEI按照特定的方法溶解并调节至所需pH值；再将HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸，4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)和氯化钙分别溶解在特定的盐溶液中，调整pH至所需范围。转染试剂在低温(-20℃)冷冻或反复冻融条件下能够长期稳定保存而保持较高活性。

本发明的另一目的是提供一种转染试剂和质粒DNA复合物的制备方法。将PEI与DNA或磷酸钙与DNA分别在不同的溶液中混合，按照不同的方式振荡形成转染用复合物，将二者分别加入细胞培养液中。12小时后换液，根据不同的目的，在特定的时间就能检测目的蛋白的表达情况。

采用本方法，可以通过简单的操作方案和低廉的价格制备转染所需的转染试剂及转染复合物。本项技术应用于蛋白生产或基因治疗及其它方面的研究，能够明显降低成本，提高产品产量和质量。

附图说明

图1 293T细胞经磷酸钙沉淀法用pR-EGFP转染后24小时在荧光显微镜下的照片；

图2 293T细胞经PEI方法用pR-EGFP转染后24小时在荧光显微镜下的照片；

图3 293T细胞经PEI-磷酸钙组合转染方法用pR-EGFP转染后24小时在荧光显微镜下的照片；

图4 293T细胞经脂质体转染法(Lipofectamine 2000)用pR-EGFP转染后24小时在荧光显微镜下的照片

具体实施方式

1.转染用PEI的制备

1)在500ml的烧杯中倒入450ml Milli-Q制备的超纯水；

2)天平称量500mg线性PEI(购自Poly Science公司)，加入烧杯中，磁力搅拌器不断搅动；

3)逐滴加入预先配好的12M浓HCl使其pH＜2.0(大约需要800μl)。搅动PEI溶液约2-3小时；

4)加入预先配制的10M NaOH 溶液将pH调至7.0(大约需要500μl)。用Milli-Q超纯水将PEI溶液定容至500ml。