[发明专利]云红梨1号金属硫蛋白基因PyMT1及其原核表达载体与应用

说明书

技术领域

本发明涉及云红梨1号金属硫蛋白基因PyMT1及其原核表达载体以及在提高微生物重金属离子耐受性上应用，属于基因工程领域。

背景技术

金属硫蛋白(Metallothionein，MT)是一类低分子量(6000-9000Da)、高半胱氨酸（Cys）含量、具有很强的金属结合能力的多肽，且广泛分布于生物界中；金属硫蛋白不但可以参与体内微量元素的储存、转运和代谢，而且具有拮抗电离辐射，清除自由基以及对重金属有解毒作用。研究表明，植物金属硫蛋白可以通过其大量的Cys残基螯合重金属并清除活性氧，使植物免受氧化损伤，同时还参与机体的生长、发育、生殖、衰老、免疫、应激甚至肿瘤的发生等多方面的生理活动。另外，金属硫蛋白也对提高植物应对自然环境中遇到的低温、干旱、重金属、过氧化氢等逆境胁迫发挥着重要的作用。如何提高植物金属硫蛋白的基因表达，利用分子生物学手段提高植物的抗逆性也是人们长期追求的目标。

随着工业的发展，土壤，地表水及地下水被工业“三废”污染越来越严重，尤其以重金属如镉，汞，铅等环境污染最为突出。自50 年代日本发生由汞引起的水俣病及近年来我国重金属污染水质的事件屡次发生，重金属造成的环境破坏以及对人类健康构成的危害越来越引起重视。 由于 MT分子中的大量巯基与金属离子尤其是重金属离子具有很强的结合力，且能被金属诱导合成，应用金属硫蛋白提高生物的重金属离子耐受性及消除重金属污染中的作用越来越成为研究和应用的重点。例如，Jin等发现表达的GST-rgMT融合蛋白的E.coli提高了对Cu²⁺, Zn²⁺和Cd²⁺的耐受性,与对照相比在添加CuCl₂, ZnCl₂ 和CdCl₂的培养基中培养6h，1 ml细胞干重分别增加0.04 mg、 0.17 mg 和 0.07 mg。Culotta等也证实了CRS5金属硫蛋白对植物体内的铜离子的稳定和解毒都起到了重要的作用菊芋在Zn²⁺和Cu²⁺重金属的诱导下HtMT2在不同组织中的表达出现了大幅的提高；拟南芥的AtMT2a和AtMT3对Cd²⁺具有一定的抗性；转化豌豆PsMTA基因菌,Cu²⁺的累积量与对照相比大幅增加，野生西瓜中的ClMT2具有强的氧自由基清除能力,杂交三叶杨PtdMTs 在Cd敏感酵母突变体中表达后，酵母则表现出对Cd的抗性。这些例子表明不同植物的MT对重金属离子都有一定的耐受性。但是果树MT基因报道较少，且云红梨1号中的MT基因的鉴定和功能分析至今未有，由于微生物在治理水污染中有着不可替代的作用，那么如何提微生物吸收耐受重金属离子的能力就成为本领域的技术人员尤为关注的问题。

 

发明内容

本发明的目的在于提供一种云红梨1号金属硫蛋白基因，该基因具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列或编码如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

本发明的目的在于提供金属硫蛋白基因PyMT1的原核表达载体，一种能产生PyMT1蛋白的含云红梨1号金属硫蛋白基因PyMT1的原核表达载体，金属硫蛋白PyMT1 基因来源于云红梨1号，其GenBank登录号为FJ393460，PyMT1基因的上游是诱导型lac启动子。

本发明中金属硫蛋白基因PyMT1的原核表达载体通过以下具体步骤构建：

（1）根据GenBank上发表的云红梨1号外果皮EST全长基因序列，设计如下特异性引物：

PyMT15’： GAATTCatgtcgtcgtgctgcggtgg

 PyMT13’： CTCGAGatcttgcagttgcatgggttgc

引物PyMT15’含有限制性内切酶EcoRI识别位点，PyMT13’ 含有限制性内切酶XhoI识别位点；

（2）从云红梨1号中提取RNA，并以RNA为模板用反转录酶合成cDNA，再以云红梨1号cDNA为模板，采用步骤（1）中设计的特异引物，在PCR扩增体系中对PyMT1基因的cDNA进行扩增，回收纯化PyMT1基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，通过PCR检测和酶切检测获得重组载体pMD18-PyMT1；