[发明专利]利用液相色谱检测系统定量口蹄疫抗原中146S含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种定量口蹄疫抗原中146S含量的检测方法，特别涉及一种利用液相色谱检测系统定量蔗糖密度梯度离心样品中口蹄疫抗原146S含量的方法。属于生物检测领域。

背景技术

在口蹄疫病毒样品中，存在4种大小不同的病毒粒子，最大的为完整病毒粒子，沉降系数为146S，稍小的一种颗粒为空衣壳，沉降系数为75S，还有一种为衣壳蛋白亚单位，沉降系数为12S，最小的一种为VIA抗原，沉降系数为3～4.5S。在动物免疫中，与刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞有关的主要是口蹄疫146S抗原，146S含有口蹄疫病毒所有的中和位点，是口蹄疫病毒的有效抗原成分。动物只有免疫足够的146S抗原才能有效的刺激机体的免疫系统，产生良好的体液免疫和细胞免疫。146S的含量是评价疫苗质量好坏的一个重要标准，目前已经报道的口蹄疫抗原定量检测技术主要有：1.细胞半数感染量(TCID50)测定2.补体结合试验(CFT)3.ELISA定量口蹄疫146S含量4.蛋白层析分析法5.荧光定量PCR进行疫苗中抗原含量的定量等。方法1是对病毒核酸进行检测，除测定完整病毒粒子外，还测定了146S裂解产物的核酸，不能完全反映病毒的免疫原性，也不能测定灭活后病毒样品；方法2准确性、敏感性不好，且不能很好的区分146S和12S；方法3需针对不同型的病毒分别筛选单克隆，成本较高周期较长，目前没有商品化的产品，仅限于学术研究；方法4，5成本较高，操作复杂，在实际生产中实用性较低。

建立一种快速准确的146S抗原定量检测方法，对于提高疫苗的生产效率和质量控制具有重要意义。中国专利公开号CN101655452A，公开日为2010年2月24日，发明创造名称为“蔗糖密度梯度紫外光定量检测口蹄疫抗原146S含量的方法”，该申请案公开了一种利用蔗糖密度梯度离心紫外光定量检测口蹄疫抗原146S含量的方法，其不足之处在于首先该发明的前期样品处理工艺复杂，而且没有充分去除样品中的杂蛋白和核酸，影响下一步定量的准确性；其次，计算公式所需参数繁杂，没有检测图谱辅以支持，而且国内外的连续流紫外光度计难以满足该公式的需求参数，应用受限。

本发明的方法利用液相色谱检测系统在259nm处连续检测蔗糖密度梯度离心样品，146S含量计算公式简便；与现有授权专利比较，本方法采用硫酸鱼精蛋白先去除部分杂蛋白和核酸，又经PEG6000浓缩进一步去除绝大部分的杂蛋白和核酸，两者的结合极大的避免了杂蛋白和核酸在259nm处的紫外吸收对146S吸收峰的影响，而且经过硫酸鱼精蛋白处理后，去除了大部分的核酸，避免了因核酸粘稠病毒重悬不彻底造成的误差，进一步提高了146S含量测定的准确性；使用精度和准确性较高的液相色谱检测系统，使得超速离心后样品的检测更加精确和快捷，根据朗博-比尔定律及定积分原理，得出计算公式，该公式需四个参数：样品通过样品池的流速、检测系统样品池光程长度、146S吸收峰面积和上样量，样品池光程是既定已知的，样品通过样品池的流速和上样量都是可控的，146S吸收峰面积由色谱工作站自动生成。采用这种方法可以精确、快速地测定口蹄疫抗原样品中146S含量，可以用于监测生产过程中病毒抗原的含量，指导疫苗配制并间接评价疫苗效力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种口蹄疫抗原146S含量定量检测的方法，本发明的方法其特征在于包括以下步骤：

(1)病毒纯化：向待测的口蹄疫病毒样品中加入硫酸鱼精蛋白，使加入的硫酸鱼精蛋白的终浓度为0.5～2.0mg/ml，室温作用0.5～2h，5000～10000rpm离心15min～1h，分离得到上清液；

所述的口蹄疫病毒为任何型或亚型的口蹄疫病毒毒株或其灭活毒株。

在本发明的具体实施例中，所述的口蹄疫病毒毒株为牛Asia I/JSL/GSZY/06毒(Asia I/JQ株空衣壳疫苗对Asia I型FMDV两株不同毒株免疫效果的测定，李志勇等，首届中国兽药大会——兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛论文集(2008))、牛O型ONXC/92毒(口蹄疫病毒O型-Asia I型二价灭活疫苗毒种种子批的建立(I)，徐春河等，中国畜牧兽医学会口蹄疫学分会第十一次学术研讨会会议论文)、猪O型O/ZK/93毒(猪口蹄疫O型灭活疫苗OZK/93株与OZK/93株+OS/99株免疫效果对比试验，徐新红等，饲料与畜牧·规模养猪2010，(9))购买自兰州兽医研究所；