[发明专利]一种超临界CO2体系中用脂肪酶膜制备甘油二酯的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及食用油脂加工领域，具体涉及以二氧化碳为流体，在超临界体系中脂肪酶膜催化甘油解反应制备甘油二酯的一种方法。 

背景技术：

甘油二酯(DAG)简称双甘酯，由甘油和两个脂肪酸酯化后得到，是油脂的天然成分。根据酰基与甘油羟基结合的位置不同可将各种不同酰基构成的甘油二酯分为1，2-DAG和1，3-DAG两类。近年来随着甘油二酯作为一种新的低脂健康食用油需求量明显增长。由于代谢途径的不同，富含1，3-DAG的健康食用油不仅与同等量的甘油三酯(TAG)有相似的热值，而且能防止体内脂肪的积累，起到预防和治疗高血脂及与其相关的心脑血管疾病的作用。 

脂肪酶是一类特殊的酰基水解酶，在动植物各种组织及许多微生物中普遍存在。但脂肪酶是水溶性的，不易回收重复使用，易失活。而酶的固定化有利于酶的分散、回收和再利用，减少了残余酶产生的再次污染。以醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜为载体固定化磷脂酶具有化学稳定性好、机械性能优异等优点，提高了酶在反应体系中的活性和稳定性，从而有利于酶的回收和产品的生产。 

超临界CO2状态下的酶促反应，是近年来生物工程新开拓的领域，许多研究表明：超临界CO2具有类似于液体的密度和类似于气体的扩散性和粘度。显示出较大的溶解能力和较高的传递特性，从而大大的降低了酶反应过程的传质阻力提高反应速率。通过简单的改变操作条件或附加其他设备就可达到底物和产物分离的目的，并且不存在溶剂残留的问题。 

发明内容：

为了克服生产甘油二酯难的问题，以便适应现代技术发展，满足市场的需求，我们提出了一种经过改进的生产工艺： 

一、复合膜的制备：将15g醋酸纤维素60℃下溶于85g二甲基甲酰胺中得到铸膜液。将聚四氟乙烯膜先用0.1mol/L的NaOH溶液和0.1mol/L的HCl溶液清洗，然后用去离子水清洗，真空干燥后，平铺在洁净的玻璃板上。控制厚度，将醋酸纤维素铸膜液用特制的刮刀涂在聚四氟乙烯膜表面，在室温下挥发适当的时间完成干相转换后，浸入去离子水完成湿相转换。12h后用去离子水清洗，自然干燥待用； 

二、脂肪酶的固定化：取若干份1cm²的醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜于三角瓶中，分别加入一定量的酶液和pH 7.5的磷酸氢二钠/磷酸二氢钾缓冲液，恒温搅拌吸附2h(25℃，170r/min)。再加入0.2％戊二醛进行交联反应，反应结束后取出酶膜，用去离子水冲洗，放于干燥处待其风干后测定酶活为17.2U/cm²。 

三、将大豆一级油和经分子筛脱水后的甘油以一定摩尔比加入到150mL不锈钢高压釜中，添加一定量的脂肪酶膜快速搅拌，加入微量的水，密封高压釜，通入CO₂进行试漏，再用CO₂置换不锈钢高压釜中的空气。置换完成后，控制温度在32℃条件下，充入CO₂压力为7.5MPa，保证反应过程处于超临界状态。在集热式恒温加热磁力搅拌器加热到一定温度后，调节一定的转速，恒温反应一段时间。反应结束后，将不锈钢高压釜冷却至室温，放出气体，打开高压釜，取出流体物，用离心机离心分离除去催化剂，得反应产物，取反应产物进行薄层层析，观察薄层层析图，然后进行液相测定，得出甘油二酯百分含量。 

本发明的有益点是： 

1、酶的固定化有利于酶的分散、回收和再利用，减少了酶的损耗和残余酶产生的再次污染，提高了酶在反应体系中的活性和稳定性，从而有利于酶的回收和产品的生产。 

2、超临界二氧化碳的使用提高了反应速率，从而改变了酶法转化率和目标产物产量低的现象。得到反应产物中甘油二酯含量可达64％。 

3、超临界体系粘度低、溶解性高，超临界状态下流体二氧化碳同时起到溶剂和催化剂的作用，是非极性分子，可避免其它方法出现中毒和催化剂失活的现象。另外，重要的是在该反应环境下可阻止甘油解逆反应，从而提高了甘油二酯的含量。 

本发明的步骤如下： 

步骤一：复合膜的制备：将15g醋酸纤维素60℃下溶于85g二甲基甲酰胺中得到铸膜液。将聚四氟乙烯膜先用0.1mol/L的NaOH溶液和0.1mol/L的HCl溶液清洗，然后用去离子水清洗，真空干燥后，平铺在洁净的玻璃板上。控制厚度，将醋酸纤维素铸膜液用特制的刮刀涂在聚四氟乙烯膜表面，在室温下挥发适当的时间完成干相转换后，浸入去离子水完成湿相转换。12h后用去离子水清洗，自然干燥待用；