[发明专利]表达载体及应用微藻产生油脂的方法

权利要求书

1.表达载体，包括：

蛋白质表达盒；和

至少两个同源重组DNA片段，分别位于该蛋白质表达盒两侧；其中该蛋白质表达盒包括：

第一筛选标记；启动子；多重克隆位点，邻接于该启动子下游；以及第二筛选标记，其中该启动子包括花椰菜叶病毒(CaMV)35S启动子、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基(RBCs)启动子、腺嘌呤甲基转移酶(AMT)启动子、硝酸盐还原酶(NR)启动子或上述组合。

2.如权利要求1所述的表达载体，其中，该至少两个同源重组DNA片段包括LB片段(SEQ ID NO：24)、RB片段(SEQ ID NO：25)、其部份序列、或上述组合。

3.如权利要求1所述的表达载体，其中，该第一筛选标记包括编码红色荧光蛋白(DsRed)的基因、编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的基因、或编码蓝色荧光蛋白(BFP)的基因，该第二筛选标记包括编码遗传霉素(G418)的基因、编码博莱霉素(Zeocin)的基因、或编码潮霉素(Hygromycin)的基因。

4.如权利要求1所述的表达载体，其中，该多重克隆位点包括限制性酶切位点SacI、EcoI、XbaI、SpeI、SmaI、EcoRI、HindIII、AccI、SalI、SciI、ApaI、KpnI、Acc65I、MRrh4273I、MthsI、MXcyI、Mcfr9I、MRsrI、McoRI、MSsoI、MSau3239I、MPaeR7I、MBstVI、PspOMI或上述组合。

5.如权利要求1所述的表达载体，其中，该蛋白质表达盒还包括至少一个外源基因，其插入该多重克隆位点。

6.如权利要求5所述的表达载体，其中，该外源基因包括选自下组的基因：

编码甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)的基因(SEQ ID NO：1～6)、

编码甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)的基因(SEQ ID NO：7～10)、

编码溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)的基因(SEQ ID NO：11～12)、

编码磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因(SEQ ID NO：13～16)、

编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)的基因(SEQ ID NO：17～21)、

编码乙酰基-CoA羧基酶(ACCase)的基因(SEQ ID NO：22)、

编码碳酸酐酶(CA)的基因(SEQ ID NO：23)、以及

与前述任一基因的序列同一性至少为80％的核苷酸序列。

7.如权利要求1所述的表达载体，其中，该表达载体在微藻中表达。

8.如权利要求7所述的表达载体，其中，该微藻包括小球藻、微星藻、杜氏藻、拟球藻、雨生血红藻或栅藻。

9.一种在微藻中表达蛋白质的方法，包括：

将一外源基因克隆入如权利要求1-6中任一项的表达载体中；

将该具有外源基因的表达载体转化至微藻中，以及

表达该外源基因。

10.如权利要求9所述的在微藻中表达蛋白质的方法，其中该转化步骤是使用电穿孔法。

11.如权利要求9或10所述的在微藻中表达蛋白质的方法，其中，该微藻包括小球藻、微星藻、杜氏藻、拟球藻、雨生血红藻或栅藻。

12.一种应用微藻产生油脂的方法，包括：

提供一种如权利要求1所述的表达载体；

将至少一外源基因插入该多重克隆位点；

将该具有至少一外源基因的表达载体转化至微藻中；以及

于微藻中表达该至少一外源基因；

其中，该外源基因包括编码与脂质生物合成相关的酶的基因或与前述基因的序列同一性至少为80％的基因。