[发明专利]检测沙丁胺醇的酶联免疫试剂盒及其方法有效

专利信息
申请号: 201110278960.0 申请日: 2011-09-20
公开(公告)号: CN103018447A 公开(公告)日: 2013-04-03
发明(设计)人: 何方洋;冯才伟;孙震;张荃;冯月君;李勇;刘琳;齐向武 申请(专利权)人: 北京勤邦生物技术有限公司
主分类号: G01N33/577 分类号: G01N33/577;G01N33/531
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摘要:
搜索关键词: 检测 沙丁胺醇 免疫 试剂盒 及其 方法
【说明书】:

技术领域

发明涉及酶联免疫检测技术,具体涉及一种检测动物组织(肌肉、肝脏)、尿液、饲料中沙丁胺醇的酶联免疫试剂盒及检测方法。

背景技术

沙丁胺醇是一种强效选择性β-受体兴奋剂药物,临床上常用于治疗支气管哮喘、哮喘性支气管炎和肺气肿患者的支气管痉挛等呼吸系统疾病。因此药可以提高瘦肉率,减少脂肪沉积和促进动物生长,被一些畜牧养殖企业作为养殖促进剂非法使用。其残留量可导致人体肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、目眩、恶心、呕吐、发烧、战栗等症状,对消费者的健康极有危害,我国农业部发布的《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》明确规定沙丁胺醇等β-兴奋剂被禁止所有用途,禁用所有食品动物。

目前,对于的残留检测主要有高效液相色谱法、液相色谱~质谱联用分析法、气相色谱法、毛细管区带电泳法、酶联免疫测定法等检测方法,仪器检测方法具有检测精确度高的优点,但其仪器化程度高,样品处理较复杂、检测费用高等,不适合用作大批样品的检测,免疫学检测方法操作简单、快速、灵敏,可同时检测多数样品,是理想的快速筛选手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种沙丁胺醇酶联免疫试剂盒及其应用。

一种沙丁胺醇酶联免疫检测试剂盒,其包括包被有包被原的酶标板、沙丁胺醇特异性抗体、酶标记物、沙丁胺醇标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、样本稀释液,所述包被原为沙丁胺醇药物抗原,所述酶标记物为酶标记抗抗体。

本发明所提供的沙丁胺醇酶联免疫试剂盒,所述沙丁胺醇药物抗原为沙丁胺醇半抗原与载体蛋白的偶联物,所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白。

所述沙丁胺醇特异性抗体为沙丁胺醇单克隆抗体,是用沙丁胺醇免疫原免疫动物得到的。所述沙丁胺醇单克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体,所述沙丁胺醇单克隆抗体优选为沙丁胺醇鼠单克隆抗体。

所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶,酶标记抗抗体是采用过碘酸钠法将标记酶与羊抗鼠抗抗体偶联得到。

为了更方便的进行大量样本筛查和现场监控,所述试剂盒还包括:沙丁胺醇标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、样本稀释液。

所述标准品溶液为系列沙丁胺醇标准品溶液,1mL/瓶,浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L。所述底物液A液为过氧化脲溶液,底物液B液为四甲基联苯胺溶液,所述的终止液为1~2mol/L的硫酸溶液,所述浓缩洗涤液为含1%吐温-20的0.15~0.2mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液,所述的样本稀释液为pH为7.4的0.02mol/L的磷酸盐缓冲液中吐温-20的含量为0.5%混合溶液配制而成的稀释液进行稀释。

其中所述酶标板在制备过程中所用到的包被缓冲液为pH9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液,封闭缓冲液为10%的小牛血清溶液。

本发明酶标板的制备主要为:用包被缓冲液将包被原稀释成0.2~0.3μg/ml,每孔加入150μl,37℃环境中避光孵育2h或4℃过夜,倾去孔中液体,洗涤液洗涤1~2次,拍干,每孔中加入150μl封闭液,37℃避光孵育2h,倾去孔中液体拍干,用铝膜真空密闭保存。

本发明中包被原和免疫原的合成过程为:

1.半抗原合成(合成路线如图1)

(1)取1-3g沙丁胺醇,溶入20-50ml DMF中,然后加入10%摩尔当量的TEMPO和10%摩尔当量的四丁基氯化铵,20-50ml 0.5M的NaHCO3水溶液,室温下搅拌30分钟后,加入1.1-1.5摩尔当量的NCS,室温反应2-5小时后,除去大部分溶剂,乙酸乙酯萃取,洗涤,干燥,除去溶剂后柱层析纯化,得到白色固体,为沙丁胺醇单氧化物。

(2)1-2g步骤(1)所得沙丁胺醇氧化物,溶入20-30ml DMF中,加入2-5摩尔当量的乙二胺,室温至100℃反应5-20小时,除去溶剂,乙醇-水中重结晶,得到白色固体,为沙丁胺醇单氧化物的乙二胺缩合产物。

2.免疫原的合成

(1)取沙丁胺醇半抗原18mg用1.5ml水溶解。

(2)取50%的GA8μl加入(1)中,室温下搅拌反应18h。

(3)取BSA100mg用5.5ml水稀释后加入上述溶液中。

(4)反应24h后加入24mgNaBH4反应2h。

(5)用三蒸水透析48小时,即得免疫原。

3.包被原的合成

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