[发明专利]一种快速检测BRCA1基因mRNA表达量的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用荧光定量PCR技术快速检测BRCA1基因mRNA表达量的试剂盒。

背景技术

铂类化合物是最常使用的肿瘤化疗药物，包括顺铂、卡铂和奥沙利铂等，具有抗癌谱广、作用强等特点。由于铂类药物通过广泛结合DNA，导致DNA链间交链或链内交链，引起DNA损伤，从而导致细胞死亡而实现抗癌目的。临床运用表明铂类药物的疗效存在显著的个体差异，铂类细胞毒性化疗药物对肿瘤损伤后，肿瘤细胞的DNA修复机制启动，具有较高修复能力的肿瘤细胞易于对化疗耐药。BRCA1在DNA修复中起重要作用，与铂类耐药关系密切，即BRCA1基因表达水平低的患者对铂类药物敏感，反之表达水平高的患者表现耐药。研究发现BRCA1基因表达水平的高低与乳腺癌、卵巢癌以及非小细胞肺癌的发病、生物学特性以及预后均有关。有文献报告，在接受铂类药物化疗较晚期的非小细胞肺癌患者中，BRCA1阳性表达者较阴性表达者预后差，BRCA1的高表达是导致肿瘤细胞对铂类药物耐药的最重要的机制之一。

微管类化疗药是作用于细胞微管，通过影响纺锤体形成，从而抑制细胞有丝分裂的一类化疗药。目前常用的抗微管类药物主要有：紫杉醇、多西紫杉醇、长春碱、长春新碱和长春瑞滨等。抗微管类药物的抗癌谱很广，是使用最为广泛的抗肿瘤药物。但在临床应用中，却时常出现治疗有效率低和副作用大的问题，存在显著的个体差异。大量的临床研究显示，抗微管药物的疗效与肿瘤组织中BRCA1基因的mRNA表达水平密切相关，即BRCA1基因表达水平高的患者对抗微管类药物敏感，反之表达水平低的患者表现耐药。

BRCA1的mRNA低表达的患者接受铂类化疗后的生存期比高表达患者显著增长，而在BRCA1 mRNA高表达的患者中，接受紫杉醇/铂类化疗的比只接受铂类化疗的患者生存期延长。因此，BRCA1基因表达的检测适应了肿瘤个体化治疗这种要求，对化疗药物选择具有指导意义。而荧光定量PCR检测BRCA1的mRNA水平比应用免疫组化定量检测BRCA1蛋白含量其敏感性及特异性均较高。

目前尚无文献报告有关检测BRCA1基因mRNA表达量的试剂盒。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种能快速、简便、敏感、特异的检测BRCA1基因mRNA表达量的试剂盒。

本发明的试剂盒利用荧光定量PCR技术，包含BRCA1基因引物、内参基因(GAPDH)引物和Taqman荧光探针：

BRCA1基因上游引物序列为：5’-ATGGGCCCTTCACCAACA-3’；

BRCA1基因下游引物序列为：5’-CACAGAAGCACCACACAGCTGTA-3’；

Taqman荧光探针：6FAM 5’-ATCAACTGGAATGGATG-3’TAMRA；

GAPDH基因上游引物序列为：5’-ATGGAAATCCCATCACCATCTT-3’；

GAPDH基因下游引物序列为：5’-CGCCCCACTTGATTTTGG-3’；

Taqman荧光探针：6FAM 5’-CAGGAGCGAGATCC-3’TAMRA。

所述的试剂盒还包括进行荧光定量PCR所需的试剂，具体包括：第一链cDNA合成试剂、阴性对照和阳性对照、PCR反应液、RNA提取试剂。

其中的第一链cDNA合成试剂为：25mmol/L MgCl₂ 4μl，10×逆转录酶缓冲液2μl，10mmol/L dNTP 2μl，RNA酶抑制剂0.5μl，Oligo(dT)₁₅ 0.5μg，AMV逆转录酶15U，无RNase去离子水。

其中阴性对照和阳性对照：以去离子水为阴性对照，以含有BRCA1总RNA样品为阳性对照。

其中的PCR反应液包括：10×PCR反应混合液、0.25pmol/μl的引物(BRCA1基因引物和内参基因引物)、0.3pmol/μl的荧光探针、2.5～4.0mM的MgCl₂、2U的Taq酶、0.2～0.4mM的dNTPs、0.2～1U的UNG酶、0.3～0.6mM dUTP、通常取1～2μl的模板。