[发明专利]快速检测赭曲霉毒素A的可视金纳米棒试纸条及制备方法

权利要求书

1.一种快速检测赭曲霉毒素A金纳米棒可视免疫层析检测试纸条，其特征在于由衬板（1）和在衬板上依次衔接的样品垫（2）、金纳米棒标记结合垫（3）、包被膜（4）、和吸水垫（5）组成，在包被膜上有用赭曲霉毒素A偶联的蛋白溶液印制的直线式隐形检测线T线（6）、用羊抗鼠IgG溶液印制的直线式隐形对照线C线（7）；

所述的衬板（1）为不吸水的硬质塑胶条或硬纸条；样品垫（2）为玻璃纤维素膜、尼龙膜、或聚偏二氟乙烯膜；金纳米棒标记结合垫（3）为载有金纳米棒标记赭曲霉毒素A抗体的玻璃纤维膜或聚酯膜；包被膜（4）为硝酸纤维素膜、聚酯膜、或羧化纤维素膜；吸水垫（5）为吸水滤纸或滤油纸；

所述的金纳米棒标记赭曲霉毒素A抗体为单克隆抗体；

所述的金纳米棒为长径比大于1.2；

所述的偶联赭曲霉毒素A的载体蛋白为：牛血清白蛋白BSA、匙孔血蓝蛋白KLH、或鸡卵清白蛋白OVA。

2.权利要求1所述赭曲霉毒素A金纳米棒可视免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于：

1) 赭曲霉毒素A全抗原的合成及鉴定：在二氧六环溶液中采用混合酸酐法分别将BSA、KLH、OVA与赭曲霉毒素A进行偶联，得到赭曲霉毒素A的全抗原OTA-BSA，OTA-KLH，以及OTA-OVA，并利用紫外扫描仪进行鉴定； 

2) 单克隆抗体的制备与纯化：以OTA-KLH作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，按常规方法制备单克隆抗体，以辛酸-硫酸铵法纯化；得OTA抗体；

3）金纳米棒的制备：在阳离子表面活性剂的保护下，通过金种生长法制备得到蓝色、红色或其它颜色的棒状金纳米棒；

4) 免疫金纳米棒的制备：利用静电作用力，将OTA抗体与带正电的金纳米棒进行偶联，制备含OTA抗体的免疫金纳米棒；

5) 包埋OTA-BSA或OTA-OVA及羊抗鼠IgG至包被膜：用喷膜仪分别将选定浓度的包被原OTA-BSA或OTA-OVA喷载于包被膜的T线，以及羊抗鼠IgG喷载于包被膜的C线上，37℃烘箱干燥10min备用； 

6) 检测试纸条的制作：将样品垫、载有抗体标记的金纳米棒的结合垫、包埋OTA-BSA或OTA-OVA抗原和羊抗鼠IgG的包被膜、吸水垫依次衔接在衬板上，组成赭曲霉毒素A金纳米棒可视免疫层析检测试纸条；

7) 样品检测：将检测试纸条样品垫插入待测样品溶液，样品将通过层析作用从试纸条上流过，10 min后根据检测线和控制线的显色情况判断结果。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的金纳米棒的制备：

在阳离子表面活性剂的保护下，通过金种生长法制备：先制备金种子，步骤如下：在1mL、0.01M氯金酸溶液中，加入28mL、0.1M CTAB溶液，轻轻混匀得到亮棕黄色的溶液，快速加入3mL 0.01M 的NaBH₄溶液，快速混匀2min，此时溶液变为淡棕黄色，将反应液在25℃水浴老化2h；用金种生长法制备金纳米棒，步骤如下：在5 mL、0.1 M的 CTAB中加入0.2 mL、0.01 M 的HAuCl₄ ?3H₂O溶液，再加入30μL、0.01 M AgNO₃，轻轻混匀，得到亮棕黄色溶液，继续加30μL、0.1M 维生素C，溶液变为无色，最后加入10μL金种溶液，静置12h以便进行生长，最后得到长径比为1.5~2的蓝色金纳米棒溶液。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的免疫金纳米棒的制备：将赭曲霉毒素A单克隆抗体与金纳米棒偶联，制备含OTA抗体的免疫金纳米棒；具体方法是：吸取适量金纳米棒溶液至小试管中，离心使金纳米棒溶液中过量的CTAB去除，随后将OTA抗体缓慢滴加入至金纳米棒悬液中，室温震荡2h，再逐滴加入5% BSA，使BSA的终浓度为0.5%，持续搅拌2h，以封闭金纳米棒上未结合的位点；低速离心去除凝聚的金纳米棒沉淀，然后再用硼酸清洗缓冲液清洗金纳米棒，即高速离心，保留底部可流动的蓝黑色沉淀，而去除含有未结合的抗体的上清液，重复2次，最后将金纳米棒转移至新管，存放4℃冰箱备用；用时用定量加样装置将已经标记有OTA抗体的金纳米棒加到结合垫上，每垫10~20μL，再放入37℃烘箱干燥1h备用，以组成试纸条。