[发明专利]不同血清型霍乱弧菌的m-PCR检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.不同血清型霍乱弧菌的m-PCR检测试剂盒，其特征在于包括如下引物和探针：

①霍乱弧菌的O1群rfb基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.1)：5′-GCCCGTTTTGCATTATGGAT-3′，

反向引物(SEQ ID NO.2)：5′-CCTTTTACCGCCGCAATACGA-3′，

探针(SEQ ID NO.3)：5′FAM-TGATCCGACAAGCCCAAATGCCACTA(MGB)-3′；

②霍乱弧菌的hlyA基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.4)：5′-GAGAAATTTGAGCGCAAAGAGGTTT-3′，

反向引物(SEQ ID NO.5)：5′-ACTTCCACCCCACCAGTCA-3′，

探针(SEQ ID NO.6)：5′NED-CCAAGCTCAAAACCTG(MGB)-3′；

③霍乱弧菌的O139群rfb基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.7)：5′-AGTTACCTGTTATGTACGATGAACC-3′，

反向引物(SEQ ID NO.8)：5′-CCATCACCAGACAAGCATACAG-3′，

探针(SEQ ID NO.9)：5′VIC-TGCTGACGCCTCTCAAGTGCCTACG(MGB)-3′。

2.不同血清型霍乱弧菌的m-PCR检测方法，包括如下步骤：

①提取待测样品DNA，得到模板DNA溶液；

②反应体系：总体积20ul，其组成为：

步骤①制得的模板DNA溶液2μl，

2×PCR Taqman GEx酶预混液10μl，

灭菌超纯水4.0μl，

SEQ ID NOS.1/2的引物对0.8μL、SEQ ID NO.3的探针0.4μL，

SEQ ID NOS.4/5的引物对0.4μL、SEQ ID NO.6的探针0.2μL，

SEQ ID NOS.7/8的引物对0.4μL、SEQ ID NO.9的探针0.2μL，

其中各引物和探针的浓度均为10μM；

以上各组分加入至0.2mL实时荧光PCR反应管中，混匀，5000r/min，离心10s；

③步骤②的反应体系按下述条件进行实时荧光PCR检测：

95℃/10min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，40个循环；

每次循环的退火时收集荧光，检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。