[发明专利]一种检测人白细胞抗原HLA-B27基因的专用引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及一种检测人白细胞抗原HLA-B27基因的专用引物及试剂盒，采用“一管双检”荧光定量PCR技术，可以有效的节约检测时间，提高检测效率。

背景技术

强直性脊柱炎(AS)是一种慢性、进行性,中轴关节受累的关节病变,其中以骶髂关节和脊柱关节受累为主要临床表现。该病早期进展较慢,但后期发展较快,很短时间内形成驼背畸形,髋、膝等关节强直。诊断主要建立在影像学检查基础上，缺乏实验室特异性诊断指标，给早期诊断带来困难，容易漏诊或误诊，使很多患者丧失了早期治疗控制病情的时机，更有部分患者因错误或不正规的用药而出现了各种并发症，甚至造成了残疾。故早期诊断显得尤为重要，是争取其良好预后的关键。

HLA-B27是一种主要组织相容性复合物Ⅰ类分子，表达于大多数人类有核细胞和血小板表面。HLA-B27基因定位于人类第6 号染色体短臂上,由8个外显子和7个内含子组成。自1973年Brewerton等率先报道, HLA-B27抗原与AS密切相关以来,世界范围内对HLA与疾病的相关性研究与探讨一直不断。不同种族、不同地区人群的研究结果显示, HLA-B27抗原与AS的相关性是迄今已知HLA与疾病相关中最强和最典型的,超过90%的AS患者其HLA-B27抗原的表达为阳性,普通人群中仅5% ～10%的为阳性。对疑似AS患者进行HLA-B27检测有助于提高早期诊断AS的可能性,为此类患者的诊断和鉴别诊断提供线索,可弥补X线不能早期诊断AS的不足。HLA-B27检测还可预测幼年特发性关节炎患儿的转归,如患者HLA2B27 阳性,则发展为AS的可能性大。同时HLA-B27 抗原检测对AS的预防亦具有一定意义,如HLA-B27阳性患者的一级亲属可检测B27,对AS进行早期诊断,及早进行干预治疗。

目前常用的HLA-B27的检测方法有微量淋巴细胞毒法、流式细胞术（FCM）、PCR-SSP和实时荧光定量PCR等方法。其中淋巴细胞毒法操作繁琐，相较而言，流式细胞仪以其快速灵敏、多参数特点在临床检测HLA-B27中得到广泛地应用，但由于存在标本不易存放，仪器昂贵等问题，促使我们探索以其他方法进行HLA—B27检测的探索。

实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性, 而且能对PCR 进行实时在线检测, 节约了大量的检测时间, 避免了遗留污染的发生。2000 年有学者开始采用实时荧光PCR 对HLA-B27 进行基因分型, 它在不增加仪器投入的前提下，较淋巴细胞毒法增加了检测效率，较FCM法则降低了对于样本的要求。常见的方法有SYBR Green I 染料法, 双探针杂交法以及Taqman技术等。

本发明申请人于2010年在中国专利申请201019146024.7中公开一种用于强直性脊柱炎辅助诊断的核酸检测试剂盒，采用实时荧光PCR技术结合Allglo探针应用于HLA-B27基因检测，即采用Allglo探针检测目的基因B27，而检测内参基因的探针是Taqman探针，由于两种探针的类型不同，采用的是双管检测，即一管检测目的基因B27，一管检测内参基因。一台96孔的荧光PCR仪只可同时检测45份样品，检测效率不高。

发明内容

鉴于现有技术中检测HLA-B27方法的不足，在目前已有的 “双管”荧光定量PCR检测HLA-B27基因的方法基础上，本发明设计了用于检测内参基因GAPDH的上下游引物、探针序列，未改变检测目的基因所用引物及探针序列，但替代原有的Allglo探针，采用同检测内参基因相同类型的Tapman探针,用“一管双检”荧光定量PCR技术检测HLA-B27基因。采用两条不同通道的荧光基团标记的Tapman探针加入一个PCR反应体系中，通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，实现“一管双检”的要求，开发了一种新型的HLA-B27基因检测试剂盒。

一种检测人白细胞抗原HLA-B27基因的专用引物，其特征在于，所述专用引物包括：

（1）用于检测目的基因的上下游引物B27-1、B27-2和探针B27-Probe，其中，

B27-1：GGGTCTCACACCCTCCAGAAT

B27-2：CGGCGGTCCAGGAGCT

B27-probe：FAM-TACCACCAGGACGCCTAC –TAMRA；

（2）用于检测内参基因GAPDH的上下游引物Gapdh-1、Gapdh-2和探针Gapdh-Probe，其中，

Gapdh-1: CAGGTGGAGCGAGGCTAG