[发明专利]碱性艳兰BO在DNA检测中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体而言，本发明涉及碱性艳兰BO(VPBBO)在琼脂糖凝胶上对DNA染色的方法，其成本低、步骤简单、操作时间短、灵敏度高而且染色后的背景颜色浅。另外，本发明还涉及检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。

发明背景

在生命科学研究领域中，作为生物体内的重要大分子，DNA是研究生命现象与本质的物质基础，其主要功能是储存、传递和表达生物体的遗传信息，DNA与生命的异常现象的发生和遗传性疾病等紧密关联。近年来随着基因组学、功能基因组学和结构基因组学的快速发展，它的应用范围越来越广，几乎渗透到生命科学的各个领域。因此，如何进一步研究和发展高灵敏度、高选择性和简便快捷的DNA测定新体系与新方法，自然成为分析研究工作者关注的研究方向。目前，琼脂糖凝胶电泳是高效分离和分析DNA分子的一种常用方法，使得凝胶上DNA的检测技术对DNA的相关研究起着至关重要的作用。

测定DNA含量的方法有多种，目前用于琼脂糖上DNA研究和测定的方法有荧光染色法、染料染色法、负染法、银染法等。DNA荧光检测法因具有快速便捷、灵敏度高等优点而成为常用的DNA检测方法之一，其使用诸如溴化乙锭(EB)、SYBR green、SYBR gold等荧光染料，如紫外光线(UV)的照射下发出荧光，可用于检测琼脂糖凝胶上的DNA条带[1-4]。然而，这些荧光染料都具有一些不可克服的缺点，尤其是EB，由于其能嵌入DNA分子双螺旋结构中，可破坏DNA样品，从而具有较强的致畸致突变作用，对实验操作者具有潜在危险；此外EB检测的凝胶需要在紫外灯下进行检识，而紫外射线常常导致核酸杂交、聚合，对其结构产生影响。，同时荧光检测仪器设备成本也比较高[5-7]。

因此，肉眼可见、操作简单、无毒、低成本的可视有机染料成为替代荧光染料为DNA染色的选择之一。已经有一些报道公开了可视有机染料用于琼脂糖凝胶上DNA的染色方法，如亚甲蓝[8]、亮甲酚蓝[9]、结晶紫[10]、以及尼罗河蓝[11，12]等。但是，这些染料染色和脱色时间长，而且灵敏度较低，普遍不如荧光染料。

为此，本发明人经过长期实践研究，令人惊讶地在发现成本低的碱性艳兰BO(Victoria pure blue BO，VPBBO)可用于在琼脂糖凝胶上对DNA染色，其可以在10分钟的染色时间内检测出低至0.8-1.6ng级的DNA，灵敏度是尼罗蓝(NB)的四倍，近似EB等荧光染料的灵敏度。另外，本发明人还发明了基于上述染色法的检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。

发明内容

本发明的目的在于提供VPBBO染色法，其能对在琼脂糖凝胶中的DNA染色，该方法安全、操作方便、成本低，而且灵敏度高。另外，本发明的目的还在于提供检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。

VPBBO是一种无毒性的萘基二苯甲烷类染料，其结构式如图1所示。本发明人经研究发现，VPBBO的分子结构和DNA分子具有很强的亲和力，但是VPBBO分子结构和琼脂糖结合的能力则弱得多，从而能够使DNA(相对于琼脂糖凝胶基质)显出颜色。

优选在本发明的第一方面中，所述染色液中碱性艳兰BO的浓度为0.001％至0.01％，优选为0.003％至0.008％，最优选为0.005％。本发明人经研究发现，VPBBO浓度过低，则染色后的颜色强度会有下降，而浓度过高，VPBBO会使背景也过多地染上色，从而降低图像的对比度，如图2。另外，在本文中如未特别指出，所述“溶液”均为水溶液，即溶剂为水，优选明示出其中所含的溶质为所述溶液中的全部溶质；也优选对于液体溶质来说，其百分比浓度指的是体积百分比浓度，而对于固体溶质来说，其百分比浓度指的是质量百分比浓度。

在现有的染色方法中，有机溶剂常用来作为染色的介质或固定剂，用以提高染色强度，从而提高灵敏度。本发明人经研究发现，加入有机溶剂乙醇能更好的溶解VPBBO并能有效提高琼脂糖凝上的DNA染色强度。所述染色液中乙醇浓度为5％至50％，优选5％至20％，最优为10％。优选所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、甘油和丙二醇之一或多种。