[发明专利]一种用于检测羊BMPR-IB基因多态性的PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和动物育种领域。具体地涉及BMPR-IB基因的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，缩写为SNP)及其与羊产羔数的相关性，涉及检测这些SNP的试剂盒。

背景技术

研究发现，Booroola美利奴羊的多胎性能是由位于常染色体上FecB基因发生突变所致，FecB基因的突变对绵羊排卵率是基因的加性效应，对窝产羔数呈部分显性效应，绵羊FecB基因实际为骨骼形态蛋白IB型受体(BMPR-IB)基因，由于该基因A746G碱基突变导致第249位的谷氨酸突变为精氨酸(Q→R)，导致绵羊排卵数和窝产羔数增加，并且证明BMPR-1B基因为影响绵羊的产羔数的主效基因，可以用于对绵羊产羔数的选择。目前，国内外研究人员开始应用BMPR-IB基因开展分子标记辅助选育多胎绵羊，新西兰Genomnz实验室正在进行BMPR-IB基因的基因标记辅助选择。刘守仁等经多年研究，培育出多胎细毛羊品系核心群，繁殖率达182％，较同等条件下的细毛羊提高60％～70％，又利用多胎基因BMPR-IB基因标记的方法，培育肉毛兼用美利奴，证明绵羊多胎性状主效基因标记辅助育种在利用优良品种与我国地方品种杂交提高产肉性能方面具有一定的优势。

对于绵羊多胎基因突变位点的检测国内外也做了大量的工作，多采用检测单个碱基的差异(或突变)来标示其多态性。近年来，SNP检测方法和相关仪器的研发进展很快，已报道并建立了多种SNP检测方法。传统的代表方法有限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms，RFLP)，单链构象多态性(single strand conformation polymorphisms，SSCP)、等位基因特异的寡核苷酸(allele-specific oligonucleotide，ASO)杂交等。对于绵羊多胎基因的检测，常用方法是PCR-RFLP，PCR之后再酶切，再电泳，费时费力。

该工作重复劳动多，消耗高，自动化程度低，该手段目前已经不适应大规模、低消耗和自动化的要求，因此，建立一种能够自动化、简便、快速的绵羊BMPR-IB基因分型方法势在必行。随着荧光定量PCR仪的普及，利用探针技术的的快速、特异性和敏感性，可以更方便快捷地进行大规模多态性检测。本研究旨在利用探针技术的优点，建立绵羊BMPR-IB基因分型方法，使之易于应用在大规模群体的检测中。

发明内容

本发明的目的即是提供一种新的用于羊BMPR-IB基因分型的PCR试剂盒。

本发明还提供了一种检测样本中是否存在BMPR-IB基因的SNP的方法，该方法包括如下步骤：

(1)利用我们自己设计的试剂盒扩增BMPR-IB基因，得到PCR扩增产物。

(2)利用FRET探针技术对扩增产物进行基因分型。

本发明中，扩增产物大小为219bp，其中含有A746G。

为实现本发明的目的，本发明的基本技术路线是：

1、提取绵羊基因组DNA，设计引物进行PCR扩增，利用RFLP进行基因分型。

2、对BMPR-IB基因第6个内含子进行测序。

3、设计探针及引物，对已经分型的样品利用FRET探针检测，最后利用测序验证分型的正确性。

利用RFLP用于对BMPR-IB基因进行分型所依据的序列可以从Genbank中获得，编号为NM_001009431；用于进行探针设计的序列是经过测序获得的。

本发明特别地提供了一种使用方便，灵敏度高的对上述基因分型的检测试剂盒，它含有PCR特异扩增引物和用于PCR扩增检测的PCR反应液(如试剂、缓冲液等常规组件)，以及用于基因分型的FRET探针等。

具体来说，本发明提供了一种快速高效检测羊BMPR-IB基因多态性的PCR试剂盒，其特征是由分离包装的引物F、引物R、探针Anchor、探针Sensor和PCR反应液构成，

其中，引物F和R的序列为：

F5-AGAGGACAATAGCAAAGCA-3；

R5-TGAACATCGCTAATACAGACTT-3：

探针Anchor、sensor序列为：

Anchor probe：AGGCCAGCTGGTTCCGAGAGA-BlackHQ；

Sensor probe：FAM-AGAAATATATCAGACGGTGTTG-PO4