[发明专利]松材线虫的冷冻保存及解冻方法

说明书

技术领域

本发明涉及线虫的冷冻保存方法，尤其涉及松材线虫的程序化冷冻保存及解冻方法，属于松材线虫的冷冻保存领域。

背景技术

松材线虫(Bursaphelenchus xyfolus)是松材线虫病的病原物，属于侧尾腺口纲，垫刃目，滑刃超科，滑刃科，伞滑刃线虫属。松材线虫病又名松材线虫萎蔫病、松树萎蔫病、松树枯萎病，是松属树种的一种毁灭性的病害，因其危害严重且防治非常困难而被世界上许多国家列为检疫对象。松材线虫危害黑松(Pinusthunbergii)、赤松(Pdensiflosa)、马尾松(Rmasso苗ana)、湿地松(P.elliottii)等多种松树，被称为松树的“癌症”。目前该病已分布于美国、加拿大、墨西哥、日本、中国、韩国、朝鲜、法国、尼日利亚和葡萄牙等多个国家，其中，在日本、中国、韩国的危害尤为严重。中国自1982年在南京中山陵风景区首次发现松材线虫病以来，至今已在江苏、安徽、浙江、山东、广东、上海、云南、湖北、湖南、江西、贵州、重庆、台湾和香港等地发生。

松树是中国的主要造林树种且其中许多种类是感病的，全中国一半以上省份的气候适合松材线虫病的发生，在中国大部分地区具备成灾和流行的基本条件，是中国林业和生态环境建设的心腹大患。自发现松材线虫病以来，国内外就展开了大量研究，一直在不断地探索其防治措施。松材线虫的低温冷冻保存能够充分利用并收集各种来源的松材线虫，可为松材线虫的致病机理和生物防治技术的研究和应用提供大量实验材料，并且不受时间和空间的限制。线虫种质资源的提供与保存作为整个研究中最为基础的一个环节，将受到人们越来越多的重视。

对于松材线虫，实验室传统的保存方法是通过在真菌上的连续接种繁殖得以实现，缺点很多，保存时间短，操作起来不仅费时、费力、占空间，而且人为因素的影响很容易造成线虫间的交叉污染，影响实验研究。因此，对松材线虫有效长期保存的研究已是迫在眉睫。上个世纪初，科学家基本上肯定了生物成分(如精子和一些生物化学物质)能够在零下温度贮存的事实。随着科学的发展，低温冷冻保存的方法逐渐走进人们的视线。随着松材线虫病的危害逐步扩大，亟需更加深入的研究其致病机理和防治措施，为此，病原物松材线虫的采集与保存作为研究的基础也越来越受到重视。

实验室传统保存方法是将松材线虫连同培养基置于(4-8℃)冰箱中保存，虽然比较有效，但因受到温度和湿度的限制，不能满足商业化制剂的要求和需要，很难进入商品化生产阶段，也由于人力和物力上的巨大消耗，难于在实验室作为种质资源长期保存的方法。受细胞冻存的启发，低温冻存也开始应用于线虫学方面。为了寻找线虫低温保存技术，各国学者从十九世纪二十年代就开始进行低温保存技术的研究。九十年代以后，科学家们更注重冷冻技术的研究，根据冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶，冻存方法可分为玻璃化和非玻璃化两种。

玻璃化冷冻应用高浓度的冷冻保护剂溶液在超速冷冻过程中形成一种极其粘稠的固化状态，从而避免细胞内冰晶形成。重要的是，玻璃化过程完全避免了冷冻细胞的在解冻直至恢复细胞生物活性中冰晶的形成。

Nakagata用玻璃化冷冻法冷冻小鼠成熟卵母细胞并取得成功后，玻璃化冷冻法被广泛的用于各种生物材料的冷冻保存研究。宋锦章等以食蚊罗索线虫(Romanomermis culicicorax)为材料研究了感染期幼虫的液氮保存，该项研究分别以不同浓度的二甲基亚矾(MDOS)、经乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮等为冷冻保护剂，结果表明：用1％、2.5％或5％的DMSO，食蚊罗索线虫感染期幼虫在液氮保存125天后大部分复苏存活，但存活的幼虫完全丧失了感染能力(宋锦章，彭玉芳，E.GPlatze，宋毅，低温贮存罗索线虫寄生前期幼虫效果观察.中国生物防治.1997，13(1)：14-16)。Annemie等用15％甘油，35％甲醇并添加0.5M的葡萄糖作为玻璃化液来冷冻保存香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)，获得了11.5％的存活率(AnllemieE.，Salvador FV Tom VW.，etal.，CryoPreservation of Radopholus similis，a tropical Plant-parasitic nematode.Cryobiology55(2007)148-15)。