[发明专利]一种大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA作为PCR标准物质的制备方法

权利要求书

1.一种提取纯化大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA作为PCR标准物质的制备方法，其特征在于利用羧基化的磁性纳米粒子提取了大肠埃希杆菌O157:H7基因组DNA；

工艺步骤为：

(1) 大肠埃希杆菌O157∶H7的培养：

按传统培养方法对大肠埃希杆菌O157∶H7进行增菌培养；

(2) 表面羧基化的磁性纳米粒子的制备：

制备羧基修饰的磁性纳米粒子，用于吸附大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA；

(3) 病原微生物大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA的提取；

(4) 用步骤(2)得到的大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA过Sephadex G-200分离柱进行分离纯化；

(5) 用步骤(4)得到的纯化后的大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA测定ICP-MS计算浓度；

(6) 将步骤(4)纯化后的DNA的PCR扩增产物进行PCR检测，琼脂糖电泳检测大肠埃希杆菌O157∶H7的目的条带。

2.根据权利要求1所述的提取纯化大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA作为PCR标准物质的制备方法，其特征在于大肠埃希杆菌O157∶H7的增菌培养：

大肠埃希杆菌O157∶H7，即ATCC 35150，接种在山梨醇麦康凯SMAC平板上，37℃培养10h，再接一环接种于10mL改良E.C新生霉素增菌肉汤，于37℃培养10h。

3.根据权利要求1所述的提取纯化大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA作为PCR标准物质的制备方法，其特征在于表面羧基化的磁性纳米粒子的制备：

①取0.65g FeCl₃，0.4g柠檬酸三钠，20mL乙二醇，搅拌反应10min；

②取1.2g醋酸钠加入①所得溶液中，搅拌反应20min；再在230℃下搅拌反应10h；

③向②所得溶液中加入20mL无水乙醇，超声10min，6000rpm离心10min，去上清；

④向③所得沉淀中加入20mL去离子水，超声10min，6000rpm离心10min，去上清；

⑤向上述步骤④所得沉淀中加入5mL去离子水，得到粒径为350nm的表面羧基化的磁性纳米粒子。

4.根据权利要求1所述的提取纯化大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA作为PCR标准物质的制备方法，其特征在于大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA的提取：

①取大肠埃希杆菌O157∶H7改良E.C新生霉素增菌肉汤培养液1mL，10000rpm离心5min，去除上清；

②将①中沉淀用1mL TE缓冲液溶解，加入100μL 10%SDS；所述TE缓冲液为pH 8.0含10mM EDTA的50mM Tris-HCl缓冲液；

③向②所得溶液中加入20μL权利要求1步骤（2）或权利要求3中制备的表面羧基化的磁性纳米粒子；

④向③所得溶液中加入370μL w/v 30% PEG 6000的6mol/L NaCl混合液，室温反应15min；

⑤将④所得溶液放入磁力架中，去除上清；

⑥向⑤所得磁粒子中加入1mL 质量浓度70%乙醇；

⑦将⑥所得溶液放入磁力架中，去除上清；

⑧向⑦所得磁粒子中加入100μL TE缓冲液溶解，65℃反应10min，所述TE缓冲液为pH8.0含1mM EDTA的10mM Tris-HCl缓冲液；

⑨将⑧所得溶液放入磁力架中，取上清，为粗提取的大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA。

5.根据权利要求1所述的提取纯化大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA作为PCR标准物质的制备方法，其特征在于采用Sephadex G-200分离柱进行分离纯化：

分离柱：Sephadex G-200；

流动相：TE缓冲液为pH8.0含1mM EDTA的10mM Tris-HCl缓冲液；

流速：0.5mL/min；

检测器：紫外检测器，发射波长：260nm； 

上样量：提取DNA样品1mL；

从6.5mL处的样品开始收集分离峰，得到的为纯化后的大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA。