[发明专利]利用天然油体重构法制备固定化脂肪酶用于生产生物柴油

说明书

技术领域

本发明涉及一种以基因工程的方法表达脂肪酶，并使用天然油体作为固定化酶基质以制备固定化脂肪酶来生产生物柴油的方法。

背景技术

1. 生物酶法制备生物柴油的概况

生物酶法制备生物柴油是利用脂肪酶的酯化和转酯反应活性，催化油脂和醇反应生成生物柴油。与物理法和化学法相比，用脂肪酶作催化剂制备生物柴油，具有应用范围广、原料选择性较低、催化效率高、反应条件温和及对环境友好、醇用量少、后处理简单、无污染物排放、副产物甘油较易分离等优点。

目前，天然的脂肪酶作为催化剂来生产生物柴油存在着一定的局限性，主要有：(1)脂肪酶对低链醇的转化率较低，致使脂肪酶用量过大、反应周期过长，脂肪酶的转酯反应活性有待进一步提高；(2)短链醇特别是甲醇对脂肪酶有一定的毒性，酶的使用寿命缩短，生产成本过高，脂肪酶的甲醇耐受性也必须进一步改善。正是这些因素制约着酶法生产生物柴油的大规模应用。

固定化酶是在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。将游离脂肪酶固定在载体上催化反应合成所需要的产物,使昂贵的脂肪酶得以重复使用, 降低了反应的成本。且固定化酶具有可以回收, 重复使用, 稳定性高,产品质量高等优点。因此，固定化脂肪酶应用前景被普遍看好。

2. 脂肪酶的固定化方法

     当前固定化脂肪酶的方法很多,可概括为物理法、化学法及生物法。由于载体材料、制备方法及固定酶的来源等不同，导致制备固定化酶的难易程度、固定效果、酶的稳定性等也有所不同。

    物理方法，包括吸附法和包埋法。吸附法是通过物理吸附将酶固定于纤维载体的一种固定化方法。 物理吸附法具有酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少的优点，另外，吸附过程可以同时达到纯化和固定化的目的，且酶失活后可重新活化再生。因而酶活力损失较少，若能找到适当的载体，这是很好的方法。包埋法是将酶物理包埋于多聚物内以达到固定化的目的。包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，因此酶活回收率较高。但是在包埋时发生化学聚合反应，酶容易失活，必须巧妙设计反应条件，使之化学反应时不至于破坏酶的活性部位和活性中心。

北京化工大学研究者将自有菌株发酵提取的脂肪酶(Candida sp. 99-125)用硅藻固定,采用酯化法直接将脂肪酸与甲醇反应,油酸和甲醇摩尔比为1∶1.4 ,反应过程中加入硅胶作吸水剂,反应24h ,酯化率可达92％。Yomi Watanabe等人运用固定的假丝酵母（Candida antarctica）脂肪酶催化豆油与甲醇反应中获得了93.8％的转酯率，并且其固定化酶循环25次之后活性没有发生任何改变。官春云等用硅藻土对实验室筛选得到的成团肠杆菌脂肪酶干燥酶粉进行固定化，转酯率达到91.03%。

化学法主要是采用共价结合法。该方法是通过酶分子之间或酶蛋白分子的功能团与载体表面上的反应基团之间以共价键相互连接，形成固定化酶。罗文等以多孔玻璃为载体，采用共价法对假丝酵母99-125脂肪酶进行了固定，并以所制备的固定化酶为催化剂，在温水体系中利用菜籽油合成生物柴油，采用3次流加甲醇的方式在石油醚中合成生物柴油，每一批次反应后过滤出固定化酶，用叔丁醇清洗后继续进行下一批次的反应，固定化酶连续反应13批(每批30 h)后，生物柴油反应转化率仍维持在70%以上。固定化脂肪酶的半衰期在390 h以上。