[发明专利]用酿酒酵母测定直接染料急性毒性的方法

权利要求书

1.用酿酒酵母测定直接染料急性毒性的方法，其特征是：在无菌条件下由以下步骤实现：

1）制备酵母悬液：将酿酒酵母冻干粉或平板培养的酿酒酵母菌落或液体培养的酿酒酵母用无菌纯净水配制或调整成细胞密度约为1.0×10^4?个?/ml的酿酒酵母菌悬液（一种染料至少需要1000 μl菌悬液），放入4℃冰箱中备用；

2）配制染料溶液：用编号的1.5 ml连盖离心管、单道可调20-300 μl量程移液器配合20-300 μl吸头配制；染料溶液的最大浓度等于或略小于该直接染料的溶解度，但不大于20000 mg/l；用量为每管130 μl；并按3倍系数进行梯度稀释，共稀释10次，得到11种浓度的直接染料待测溶液共2组，见图1；

3）建立培养体系：由2组每组12个1.5 ml连盖离心管构成，每组前11个离心管均为待测染料溶液，每组最后1管用无菌纯水代替待测染料溶液，其成分构成分别为：待测染料溶液∶YPD(YEPD)液体培养基(2.2倍)∶酿酒酵母悬液=130 μl∶110 μl∶20 μl；均采用单道可调20-300 μl量程移液器配合20-300 μl吸头加入；

4）进行细胞培养：盖好离心管盖，在温度30?℃、转速150 r/min条件下震荡培养6-7.5小时；

5）计数悬液制备：将培养管放入小型离心机中，用4000 r/min离心10 min，弃上清液，用PBS(pH 7.4)缓冲液300 μl洗涤各细胞团2次（每次洗涤均是将细胞悬浮，然后立即离心并弃上清液），将各洗涤后的细胞团分别用PBS(pH 7.4)缓冲液配制成260 μl菌悬液；

6）测定细胞数目；用基于电阻法细胞计数原理的手持式细胞计数器测定各管菌悬液的细胞浓度；或用平板菌落计数法测定各管菌悬液的菌落形成单位(clone forming unit, CFU)；

7）求算染料EC₅₀范围：将所测得的各管菌悬液的细胞浓度减去初始细胞浓度，除以对照管菌悬液的细胞浓度，或将所测得的各管菌悬液的CFU减去初始CFU，除以对照管菌悬液的CFU，并换算成百分数，定义为细胞分裂率；将相同浓度染料的细胞分裂率平均，将染料浓度除以2所得数值为横坐标、平均细胞分裂率为纵坐标绘图，得到一条曲线，通过纵坐标上的一点(0,50)作X轴的平行线，交曲线于A点，过A点作Y轴的平行线，交X轴于B点，B点的横坐标数值即为所求染料的EC₅₀值，但一般尚难以确定，故将B点附近对应的染料浓度分别记为L和H，X轴上的线段LH所对应的染料浓度即为染料EC₅₀范围，见图2；

8）测定和求算染料EC₅₀：重复步骤2)至步骤7)，但步骤2)中的梯度稀释系数需根据染料EC₅₀范围重新确定，即：分别将L和H以科学计数法表示(a×10的n次幂的形式)，分别将a取整，得到L’和H’，以L’和H’为再次测定过程中的染料溶液的浓度范围；B1点的横坐标数值即为所求染料的EC_50-粗略值，见图3，并将B1上下两个浓度值分布记为L₁和H₁，将线段L₁H₁分成10等份，观察B1对应的小刻度数值，并记为b；然后根据公式(H₁- L₁)÷10×b计算出EC₅₀值，见图4。

2.根据权利要求1所述的用酿酒酵母测定多种直接染料急性毒性的方法，其特征是，用96孔细胞培养板(或酶标板)代替1.5 ml连盖离心管、8道可调20-300 μl量程移液器代替单道可调20-300 μl量程移液器、小型冷冻高速离心机换上96孔酶标板吊篮转子，则每两个96孔板可求得4种染料的EC₅₀。