[发明专利]牛体细胞病毒诱导方法

说明书

[技术领域]

本发明涉及细胞诱变技术领域，尤其涉及一种牛体细胞病毒诱导方法。

[背景技术]

在自然界中物竞天择适者生存是自然选择的结果，生命机体在自然界生存 过程中不断地调整自己以便更好地适应自然环境。诱变在新品种培育的过程中 发挥着重要的作用，在当今的世界广大科技工作者积极投身到动植物的新品种 培育，以期获得优质、高产、生产性能强的动植物品种。为了得到优秀的动植 物新品种个体国家开展了太空育种，将动植物的种子或个体带到太空，这些材 料在太空高强度紫外线、电离辐射等的情况下遗传生物信息发生改变，即突变， 有利的遗传信息的突变会产生优质、高产、生产性能强的动植物新品种，从而 服务于人类的生产和生活。发生诱变的生物材料由于正常细胞的DNA或基因发 生突变，遗传性状发生变化，并具有稳定的表型变化，变异性状能够稳定的遗 传给后代。一般情况下，引发生物材料发生诱变的因素称为诱变剂，常见的有 高温、电离辐射、化学药物等。慢病毒载体作为一类重组逆转录病毒载体在转 基因生产中具有方便、快捷、高效和稳定转染等优点，目前已成为一种重要的 基因转移工具被广泛应用于基因导入细胞分子生物学研究领域。慢病毒是逆转 录病毒家族的成员，病毒能够利用自身组分将外源基因整合入宿主细胞基因组 中，从而使外源基因随着宿主细胞的分裂增殖和传代而稳定表达。在试验中发 现慢病毒多次感染牛胎儿成纤维细胞后能够引起细胞发生诱变，诱变的细胞在 形态和生长性能等方面呈现特征性变化，表现出一定干细胞特征，为探讨细胞 在生长、发育和重构等方面提供理想的材料和手段。

[发明内容]

本发明要解决的技术问题是提供一种牛体细胞病毒诱导方法。使用该方法 可以简单、高效、快速地引起牛体细胞发生诱变。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，牛体细胞病毒诱导方 法，包括如下步骤：

1)取怀孕2.5月龄牛的胎儿，采用组织块培养法建立牛的胎儿成纤维细 胞系；

2)磷酸钙介导pLentilox3.7慢病毒表达载体及其包装组分在293T细 胞中包装形成慢病毒颗粒，12-16h后更换新鲜高糖DMEM培养液，病 毒包装48h后收集含慢病毒的高糖DMEM培养液，经超滤浓缩后添加 到牛胎儿成纤维细胞培养板内；

3)每天病毒感染一次，共计使用病毒液感染细胞4次，病毒感染2次后 更换含1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液；

4)当细胞形态出现集落变化后，将细胞集落经Di s pa se消化后接种到经 丝裂霉素处理的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上培养箱中培养。

本发明的有益效果是：

通过慢病毒多次感染牛胎儿成纤维细胞后能够简单、高效、快速地引起细 胞发生诱变，诱变的细胞在形态和生长性能等方面呈现特征性变化，表现出一 定干细胞特征，牛体细胞病毒诱导方法诞生的诱变细胞将会作为一种新型的细 胞材料在牛的转基因克隆、新品种培育、育种改良及细胞基因表达调控等方面 发挥重要的作用，同时，也为人类及其他物种的细胞提供借鉴和参考。

[附图说明]

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是出现诱变的牛胎儿成纤维细胞的生长形态；

图2是诱变形成的细胞集落在饲养层上的生长形态

[具体实施方式]

一、细胞培养和慢病毒感染

取怀孕2.5月龄牛的胎儿，采用组织块培养法建立牛的胎儿成纤维细胞系。 磷酸钙介导pLentilox3.7慢病毒表达载体及其包装组分在293T细胞中包装形 成慢病毒颗粒，12-16h后更换新鲜的高糖DMEM培养液，病毒包装48h后收集 病毒液，经超滤浓缩后添加到牛胎儿成纤维细胞培养板内，细胞密度为 1.0×10⁴/cm²，每次病毒感染间隔24h，共计病毒液感染细胞4次，病毒感染2 次后更换含1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液，细胞形态出现集 落变化后，1mg/ml Dispase消化后接种到经丝裂霉素处理的12.5d小鼠胎儿成 纤维细胞饲养层上培养箱中培养。

二、免疫荧光分析