[发明专利]一种二氧化钛纳米颗粒的细胞生物安全性评价方法

说明书

技术领域

本发明涉及纳米颗粒的细胞生物安全性评价领域，具体地说，是一种从代谢网络变化的角度评价二氧化钛纳米颗粒的细胞生物安全性评价方法。

背景技术

纳米颗粒因具有尺寸效应、体积效应和表面效应等特殊性能，被广泛应用在工业生产和生物医药领域，用来提高原有产品的性能或获得新的功能。然而，随着纳米材料的大量商品化，纳米颗粒类物质的生物安全性问题如对环境和人类健康可能带来的危害等倍受关注。目前，关于纳米颗粒的生物安全性研究主要集中在整体动物效应（包括对生理功能的影响）、细胞生物学效应及其机制、大气纳米颗粒对人体作用和影响等领域，并一致认为纳米颗粒的剂量、粒径、形状、化学组成、分散状态、表面特征如表面电荷、化学物修饰等是影响细胞行为和功能的主要因素。

纳米二氧化钛，具有优异的紫外线屏蔽性和良好透明性等特点，已成为防晒化妆品的理想原料。同时，由于二氧化钛电子结构所具有的特点，光催化作用持久，具有持久的杀菌、降解污染物效果。此外，纳米二氧化钛还常被应用于催化剂、医药卫生和食品添加剂等。二氧化钛纳米颗粒主要通过皮肤（化妆品）、呼吸（工业生产）、摄入（药物、食品）和血液循环等途径进入人体。

关于纳米二氧化钛的生物安全性研究主要集中在器官恶化、细胞形态学和生物氧化层面（高峰，蓝闽波，袁慧慧，黄永平，刘建文，赵红莉，王芬，2010，专利号：CN101671722A），而纳米二氧化钛对细胞内各种细胞器、生物大分子、遗传信息的破坏机制尚待明确。Kang等人（Kang, S.J. Kim, B.M. Lee, Y.J. Chung, H. Environmental and Molecular Mutagenesis, 2008, 49: 399-405）发现二氧化钛纳米颗粒触发了与细胞周期相关的功能性蛋白p53磷酸化。

尽管人们已逐步关注到只有在系统水平上对所有成分整体分析才能全面正确的认识生物体的多种生理功能，研究二氧化钛纳米颗粒的生物安全性也开始涉及系统生物学层面，Bu等人（Bu, Q. Yan, G. Deng, P. Peng, F. Lin, H. Xu, Y. Cao, Z. Zhou, T. Xue, A. Wang, Y. Cen, X. and Zhao, Y. Nanotechnology, 2010, 21: 125105 (12pp)）利用核磁共振波谱仪（NMR）技术研究发现口服二氧化钛纳米颗粒的大鼠，其体液代谢小分子均出现不同程度的变化。然而，从代谢分子水平研究二氧化钛纳米颗粒如何诱导细胞坏死和凋亡的代谢机制尚不清楚。因此，有必要建立代谢网络，通过观察细胞代谢网络中不同代谢物的变化，寻找二氧化钛纳米颗粒影响细胞生物安全性的代谢标志物和作用靶点，全面解析二氧化钛纳米颗粒诱导细胞损伤的内在代谢通路。迄今为止，通过细胞构建的代谢网络变化评价二氧化钛纳米颗粒细胞生物安全性和潜在代谢机制尚无报道。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种纳米颗粒的细胞生物安全性的评价方法，主要内容为测定与二氧化钛纳米颗粒细胞生物安全性密切相关的代谢差异物，通过分析技术结合统计学方法，研究二氧化钛纳米颗粒影响细胞能量代谢（如糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、三羧酸循环）、戊糖磷酸途径、核苷酸代谢、脂代谢、氨基酸代谢的过程，寻找二氧化钛纳米颗粒对细胞的作用靶点，综合评价二氧化钛纳米颗粒诱发细胞代谢网络变化的机制，这将有助于从代谢层面评估二氧化钛纳米颗粒对细胞生物安全性的影响。

本发明是通过以下技术方案实现的，包括如下步骤：

第一步，纳米颗粒的分散：选用在培养液中中性的、分散性好的、性能稳定的、粒径小于100nm的锐钛矿型纳米二氧化钛，并且也可以采用其它晶型的二氧化钛纳米颗粒。

第二步，细胞培养和模型建立：根据二氧化钛纳米颗粒对细胞生物安全性评价需要，筛选建立二氧化钛纳米颗粒处理的细胞模型，以及相应的正常对照。选用标准细胞接种于培养皿上，并使用培养液进行培养。模型组中根据二氧化钛纳米颗粒对细胞生物安全性评价需要，待细胞长至60%后，改用灭菌的含有上述第一步中的二氧化钛纳米颗粒的培养液培养。

第三步，样品前处理：采用细胞破碎和溶剂提取方式获取细胞中小分子代谢物；根据样品分析方法，样品提取物可以不进行衍生处理，也可以利用衍生化试剂进行衍生处理。