[发明专利]一种分离鱼类反转座子SINEs的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及利用鱼类基因组内反转座子SINEs起源的特殊性、及其在基因组内的分布特点，选择特定的DNA序列设计独特的引物，运用分子克隆的方法，分离鱼类基因组内含有反转座子SINEs的目的片段。 

背景技术

反转座子SINE的基本结构一般由三部分组成：5’端的头部、躯干部和尾部。头部为RNA相关区，衍生于相应的7SL RNA，tRNA或者5S rRNA；躯干部来源不明，且长度也有变化；尾部为长度可变的具有简单重复序列区。在真核生物基因组中，SINE大约为10³-10⁵拷贝数，长度一般在100-600bp之间。SINEs通过RNA聚合酶III转录为RNA，经反转录酶作用形成的cDNA随机插入到基因组中，引起宿主基因组的突变，可作为一种有应用价值的分子标记，应用于物种鉴定和生物进化方面的研究。SINE的插入与特定的重组相关联，影响机体的应激反应和基因调控，同时，SINE插入的拷贝可成为宿主基因组的启动子、增强子，沉默子和功能基因的来源。已有研究表明，尽管属于同一家族的SINE，但其拷贝间的序列差异较大，最高可达35％；不同科属的生物类群，具有特定的SINE；这此特性为克隆生物基因组内的SINE带来了困难。 

目前，较为有效的分离生物基因组内的SINE的方法6种：1、pre-mRNA法。原理是利用SINE互补的pre-mRNA具有长发卡结构特点，首先获得发卡序列并用作探针，然后扫描基因组文库，找到SINE的全序列。2、基因组重复序列杂交法。利用SINE为大量拷贝而基因为单拷贝的特点，将标记的基因组DNA与基因组文库相杂交，去掉基因序列，找出重复序列的阳性克隆，然后再多次杂交，测序，过滤基因序列，最终得到SINEs。3、体外转录法。以基因组DNA为模板，使用RNA聚合酶III进行体外转录，获得RNA并标记成探针，与基因组文库杂交，筛选阳性克隆，测序，获得SINE。4、A-B PCR法。以RNA聚合酶III的Box A和Box B序列设计1对引物(A和B)，A-B PCR扩增得到tRNA相关的约50bp的核心序列，该序列标记成探针，与基因组文库杂交，筛选出SINEs。5、A-PCR法，也称改进的A-B PCR法。引物A在基因组内进行PCR，弥散的PCR产物构建文库，A-B PCR产物标记后扫描该文库，筛选阳性克隆并测序，获得BoxA下游序列；根据已知序列设计正反引物，标记PCR产物并用作探针，扫描基因组文库，得到全长的SINEs序列。6、磁珠富 集法。该方法以A-B PCR法为基础，获得约50bp的核心序列，再以反向PCR法获知核心序列两侧序列，以该序列为探针，通过生物素标记使此序列与磁珠耦合，然后与基因组文库杂交，捕获并分离基因组内SINEs。 

以上用于分离SINE的方法，关键在于SINE核心序列的特异性，但所涉及获取核心序列的步骤都较为繁锁，且仅适用于特定的生物类群。本发明利用两次单引物PCR，无需体外转录、扫描基因组文库、或反向PCR，便能实现快速有效的分离鱼类SINE的核心序列，以此序列标记为探针，通过该探针与基因组文库杂交或与磁珠耦合后再与基因组文库杂交，将可获得鱼类SINE全长序列。 

发明内容

本发明旨在提供一种基于PCR分离鱼类基因组DNA中SINE的方法，该方法简单，通过两次单引物PCR扩增，就能直接获取基因组DNA中SINE的片段。 

本发明是通过以下技术方案实现上述发明： 

①实验材料：鲱形目鳀科鲚属的刀鲚Coilia nasus、凤鲚C.mystus和七丝鲚C.grayi；黄鲫属的黄鲫Setipinna taty；棱鳀属的赤鼻棱鳀Thrissa kammalensis；小公鱼属的中华小公鱼Anchoviella Chinensis。鲇形目鲿科黄颡鱼属黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco。鲈形目弹涂鱼科大弹涂鱼属大弹涂鱼Boleophthalmus pectinirostris。 

②提取DNA：剪取一小块新鲜的肌肉组织(约50g)，用DNA裂解酶56℃水浴消化2-3小时，然后按照上海生工的UNIQ-10柱式基因组DNA提取试剂盒进行操作，1％的琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA质量，-20℃保存备用。 

③引物B设计(见附图1)：根据不同鱼类的tRNA的聚合酶III的Box B序列高度保守性特点，设计1个独特引物B，由上海生工公司合成，引物序列：5’-GAGGAYTTGAACC-3’。