[发明专利]一种快速高效筛选L-精氨酸高产菌株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于L-精氨酸缺陷型菌株，快速高效筛选L-精氨酸高产菌株的方法，属于工业微生物育种技术领域。

背景技术

L-精氨酸是人体和动物体内的半必需碱性氨基酸，是合成蛋白质肌酸的重要原料，也是生物体尿素循环的一种重要中间代谢产物，因此在医药和食品工业中具有广泛用途。

发酵法生产L-精氨酸是目前商业化生产比较有效和经济的方法，而优良的L-精氨酸高产菌株是发酵生产L-精氨酸的关键。目前L-精氨酸高产菌株的选育主要是通过传统的诱变育种和现代基因工程育种获得，其中基因工程育种因其目的性强，工作量小而倍受研究者们青睐，而诱变育种获得的菌种生产性能往往较稳定，因此仍在生产实践中广泛运用。生产实践中还发现，产L-精氨酸菌种在保存传代过程中，生产性能会逐渐衰退，产酸和转化率会不断下降，因此必须定期进行复壮，即从衰退的菌株中，通过分离、纯化筛选出未衰退的菌株，这样才能保持菌株的高产性能，不断满足生产需要。无论是用传统诱变、用现代基因工程手段对现有L-精氨酸高产菌株的改造，还是高产菌株的复壮，都需要从众多的单菌株中挑选出高产菌株。所以，高产L-精氨酸菌株的选育工作在L-精氨酸的发酵生产中必不可少。传统的L-精氨酸高产菌株的筛选主要是通过筛选抗L-精氨酸结构类似物菌株，抗结构类似物抗性强的菌株其产量相应就会较高。但是，由于L-精氨酸的结构类似物种类较多且价格昂贵，因此使得筛选工作强度大、效率低且成本较高。

本发明从另一角度出发，建立了一种快速高效筛选L-精氨酸高产菌株的平板显色法。微生物中从L-谷氨酸合成L-精氨酸有3条途径：线性途径、循环途径及新发现的利用氨甲酰基转移酶进行L-精氨酸生物合成的新途径，大肠杆菌及古细菌主要以线性途径合成L-精氨酸，而酿酒酵母、谷氨酸棒杆菌、假单胞菌等微生物则以循环途径合成L-精氨酸，图1。大肠杆菌中，L-精氨酸合成途径中的N-乙酰谷氨酸激酶argB恰好位于精氨酸琥珀酸酶argH的上游，本发明通过敲除argH基因获得L-精氨酸缺陷型大肠杆菌，以E.coli BL21基因组DNA为模板PCR获得argBH基因片段，在argH内部插入卡那霉素抗性基因(Kan)，实现对argH的敲除从而获得该酶缺失的L-精氨酸缺陷型大肠杆菌。将L-精氨酸缺陷型菌株作为L-精氨酸分泌的指示菌通过交互共养法以TTC为显色剂实现钝齿棒杆菌胞外精氨酸浓度高低的定性筛选，在平板上初筛出合成L-精氨酸能力高或分泌性能较优型菌株，进而再通过摇瓶发酵复筛，该方法大大提高了菌种选育中的筛选效率而且节约了成本。因此，本发明对筛选高产L-精氨酸菌株有着积极的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于大肠杆菌L-精氨酸缺陷型菌株，快速高效筛选L-精氨酸高产菌株的方法。

本发明的技术方案：首先构建大肠杆菌BL21L-精氨酸缺陷型菌株，应用该菌株平板显色法筛选L-精氨酸高产菌株。

大肠杆菌BL21L-精氨酸缺陷型菌株构建方法如下：

(1)argBH的扩增：以E.coli BL21基因组DNA为模板，用引物P15’-CGCGAATTCATGAATCCATTAATTATCAAACTGG-3’(EcoR I)、P25’CGCGTCGACTTACCCTAACCGAGC CTGC-3’(Sal I)扩增argBH基因，扩增循环条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，56℃退火90s，72℃延伸90s，35个循环。

(2)质粒pMD-18T-argBH::Kan的构建：PCR获得的argBH基因片段电泳胶回收后与pMD-18T载体16℃过夜连接，转化E.coli JM109，挑取阳性转化子并验证获得E.coli JM109(pMD-18T-argBH)。将T-Kan用EcoRV酶切后胶回收其中大小约为1.4kb的包含Kan抗性基因的片段，并将其与同样用EcoRV酶切后的T-argBH进行连接(EcoRV位点位于argH内部)，转化E.coli JM109，挑取阳性转化子并验证获得E.coli JM109(T-argBH::Kan)。