[发明专利]一种检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列及其应用

权利要求书

1.一种检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列，其特征在于：

ureRF1：5’-GGTGAGATTTGTATTAATGG-3’

ureRR1：5’-ATAATCTGGAAGATGACGAG-3’。

2.一种权利要求1所述的检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列的应用，其特征在于：所述奇异变形杆菌特异的核酸标识序列应用于检测环境中的奇异变形杆菌。

3.按权利要求2所述的检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列的应用，其特征在于：采用普通PCR定性检测奇异变形杆菌，具体过程为：

(1)以核酸标识序列ureRF1和ureRR1为正向引物和反向引物进行PCR，15μl的PCR的反应体系，PCR体系的反应条件为94℃变性4min，然后94℃变性40sec，58℃退火1min，72℃延伸30sec，30个循环，最后72℃继续延伸10min；

(2)所得PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结果在凝胶成像分析系统中进行分析，检测PCR产物的有无和大小。

4.按权利要求3所述的检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列的应用，其特征在于：所述PCR的反应体系为：15μl的PCR反应体系分别加入以下体积的物质，1.5μl的10×PCR缓冲液，0.5μl的10μmol l^-1正向引物，0.5μl的10μmol l^-1反向引物，1.5μl的dNTP混合物，1μl的模板，0.25μl的Taq DNA聚合酶，9.75μl的灭菌双蒸水。

5.按权利要求4所述的检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列的应用，其特征在于：所述10×PCR缓冲液为200mmol l^-1Tris HCl(pH 8.4)，200mmol l^-1KCl，15mmol l^-1MgCl₂。

6.按权利要求3所述的检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列的应用，其特征在于：所述步骤(2)琼脂糖凝胶电泳中出现225bp的DNA片段即为，检测样品中含有奇异变形杆菌。

7.按权利要求2所述的检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列的应用，其特征在于：采用实时荧光定量(real-time，RT)PCR定量检测奇异变形杆菌，具体过程为：

(1)将奇异变形杆菌按10倍的浓度梯度分别稀释，将稀释液10,000rpm离心5min收集菌体，提取细菌的基因组DNA，作为实时荧光定量PCR模板；

(2)分别以核酸标识序列ureRF1和ureRR1为正向引物和反向引物进行实时荧光定量PCR，20μl的实时荧光定量PCR反应体系，实时荧光定量PCR的反应条件为：94℃变性30sec，然后94℃变性5sec，58℃变性和延伸20sec，循环40个循环，最后94℃热变性15sec，58℃变性和延伸1min，94℃热变性15sec；

(3)数据分析：以细菌的浓度(CFU ml^-1)为横坐标，以达到荧光阈值所需要的循环数(Ct值)为纵坐标，绘制散点曲线，即可定性地检测样品中的奇异变形杆菌的数量。

8.按权利要求2所述的检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列的应用，其特征在于：所述步骤(1)将奇异变形杆菌按10倍的浓度梯度分别稀释至终浓度为1.0×10⁸，1.0×10⁷，1.0×10⁶，1.0×10⁵，1.0×10⁴，1.0×10³，1.0×10²和1.0×10¹CFU ml^-1，收集1ml不同浓度梯度的奇异变形杆菌稀释液，提取基因组DNA，待用。

9.按权利要求2所述的检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列的应用，其特征在于：所述步骤(2)中的实时荧光定量PCR反应体系，PCR的反应体系分别加入以下体积的物质，10μl的SYBR Premix，0.5μl的10μmol l^-1正向引物，0.5μl的10μmol l^-1反向引物，0.4μl的ROX校正液和1μl的模板DNA，7.6μl的双蒸水。