[发明专利]三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因及其编码蛋白和应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体的说是一种三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一种重要的海产经济蟹类，由于其营养价值丰富、生长迅速等优点，已成为我国重要海水养殖品种。但随着养殖规模不断扩大以及集约化程度不断提高，由细菌、真菌等引起的多种疾病在三疣梭子蟹养殖群体中频频爆发，造成了巨大的经济损失，严重制约了三疣梭子蟹养殖产业的健康可持续发展。

由于对三疣梭子蟹的免疫系统缺乏深入了解，目前蟹病的防治仍主要采用传统抗生素药物防治，但长期盲目滥用药物，造成抗药性问题日益严重，非但难以有效地控制病情，反而带来资金的浪费，蟹品质的下降，环境污染及对人类健康构成潜在威胁等不良后果。因此，这就迫切需要从三疣梭子蟹自身的免疫防御因子入手研究其抗病机制和开发新型的抗菌药物进行免疫防治。

抗脂多糖因子(ALF)是一种能够结合脂多糖(LPS)并中和其毒性作用的小分子抗菌肽，因其作用机制与传统抗生素不同，细菌不易产生耐药性，对正常真核细胞无毒害，日益受到广泛关注。ALF最初是从美洲鲎中发现，它可以结合LPS，并对R型革兰氏阴性菌有明显的抑制生长作用。晶体结构分析表明，鲎ALF结构中有两个高度保守的半胱氨酸残基，它们形成二硫键所限制的β折叠区域即为LPS结合域。体外合成鲎ALF的LPS结合域，证明其确实可以与LPS结合，能够在体外调节细胞因子的分泌，有助于保护小鼠免受内毒素的攻击。随后，从对虾、螯虾、蟹等甲壳动物中也鉴定或克隆出多种抗脂多糖因子。研究表明这些甲壳动物ALF的表达水平在细菌刺激后明显上调，其重组蛋白能够抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的生长，提示ALF在甲壳动物固有免疫中发挥重要作用。

到目前为止，关于三疣梭子蟹抗脂多糖因子的报道较少。因此，识别、定性抗菌效应分子-抗脂多糖因子对研究三疣梭子蟹的免疫防御机制和进行病害防治具有重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因及其编码蛋白和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因：三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因为序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示。

三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因编码蛋白：所述PtALF-6基因编码蛋白为序列表SEQ ID No.2中氨基酸序列所示。

三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因编码蛋白的应用：所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因的重组表达产物可制备为抗菌药物、免疫增强剂、饲料添加剂、防腐剂或保鲜剂。

所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因的重组表达产物可作为革兰氏阴性菌、真菌的抑菌药物。所述革兰氏阴性菌为溶藻弧菌、铜绿假单胞菌、爱德华氏菌，真菌为毕赤酵母。

本发明所具有的优点：

本发明利用表达序列标签技术(EST)、RACE技术从三疣梭子蟹中克隆到PtALF-6基因cDNA全长序列，通过PCR技术扩增编码PtALF-6成熟肽的基因片段并将其克隆到pET32a(+)表达载体中，在大肠杆菌BL21(DE3)-plysS实现体外重组表达。重组蛋白经TALON柱纯化和透析复性后，对革兰氏阴性菌溶藻弧菌、铜绿假单胞菌、迟缓爱德华氏菌、真菌毕赤酵母具有显著的抑菌活性，最小抑菌浓度分别为1.00μM、2.01μM、16.08μM、16.08μM；而对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌没有明显的抑制作用。

本发明基因及其重组蛋白在药物生产、免疫增强剂、饲料添加剂以及防腐剂和保鲜剂生产中的应用，另外还可以进一步研究三疣梭子蟹免疫防御机制提供基础，并为三疣梭子蟹的病害防治、基因辅助选育和饲料添加剂。

附图说明

图1为本发明实例提供的纯化的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6编码成熟肽的基因扩增产物(其中，M：DNA marker，1：成熟肽的基因扩增产物)。

图2为本发明实例提供的诱导和纯化的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6重组蛋白(其中M：蛋白marker；1：未诱导菌体中表达的蛋白；2：IPTG诱导后表达的蛋白；3：纯化的重组蛋白)。

具体实施方式

下面的实施例中将本发明作进一步阐述，但本发明不限于此。

本发明中的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6的cDNA序列克隆包括下列步骤：