[发明专利]一种分子标记鉴定杂交大豆种子的方法

说明书

技术领域

本发明公开一种分子标记检测杂交大豆种子的方法，适用于RN型细胞质雄性不育“三系”育成的杂交大豆审定品种种子纯度的鉴定，属于植物分子标记检测技术领域。

背景技术

利用杂种优势是大幅度提高大豆单产最有效的措施之一。我国在大豆杂种优势研究领域处于国际领先地位，吉林省农业科学院利用细胞质雄性不育“三系”于2002年育成并审定了世界上第一个大豆杂交种“杂交豆1号”，比对照增产20.9%。之后吉林省农业科学院又育成并审定了杂交豆2号、3号、4号和5号，安徽省农业科学院育成并审定了杂优豆1和2号，阜阳市农业科学研究所育成并审定了阜杂交豆1号。目前这些杂交种部分已在生产上应用，这标志着大豆杂种优势利用进入产业化开发阶段。然而优良杂交种的推广应用需要大量优质的种子，杂交种纯度的高低直接影响着杂交大豆的产量和农民种植杂交种的积极性。为保护农民的利益，降低因纯度低而导致的减产，迫切需要进行大豆杂交种纯度的检验工作，并建立一种准确、简单、快捷的杂交种纯度鉴定方法。

大豆种子纯度常规鉴定多采用形态学鉴定法和生化鉴定法。形态学鉴定法是依靠种子或植株的表型性状来鉴别不同的个体，该方法比较直观、简便，但由于可直接观测的农艺性状十分有限，有些性状要在特定的生育期才能检测，有些性状易受环境条件的影响，从而受到很大限制。关键是如果混杂的材料在表型上与被鉴定杂交种的性状完全一致，采用这种方法就无法鉴定出伪杂种。生化鉴定法是通过鉴别不同品种基因表达产物蛋白质之间的特异性差异来鉴定种子纯度。该技术的应用对准确、快速检验种子纯度起了很大的推动作用，但由于其多态性较低，且有组织和器官特异性，使取材受到严格限制，从而限制了其应用。

发明内容

本发明提供一种分子标记鉴定杂交大豆种子的方法，解决了现有用于种子纯度鉴定鉴定法存在的诸多缺陷，具有省时、省力、方法简单，操作方便，鉴定快速，准确可靠，工作效率高等特点。

实现本发明提供一种分子标记鉴定杂交大豆种子的方法，包括以下步骤：

（1）提取大豆杂交种种子的基因组DNA；以基因组DNA为模版，用引物JLHSSSR1进行扩增；

引物序列为：

上游引物：5’-GCAGCTTGCTCAGAACATCA-3’，

下游引物：5’-AAACCCTAACGCCGTTTCTT-3’；

（2）对扩增产物进行凝胶电泳；

（3）对电泳结果进行分析，其中：

SSR引物JLHSSSR1产生的母本特异标记为两条；产生的父本特异标记也为两条；通过应用JLHSSSR1对杂交大豆种子的标记基因型进行分析，只有同时具有亲本特异条带的单株才是真正的杂交种，缺少其中任意一个条带或无亲本条带，均被视为假杂种，检测得到的纯度结果的平均值即为杂交大豆种子的纯度。

杂交大豆基因组DNA的提取： 

取一粒杂交大豆种子置于研钵中，加入液氮研磨成粉末，取0.2g粉末倒入1.5 ml离心管中，向离心管中加入600ml 65℃预热的1×CTAB缓冲液和40ml巯基乙醇；将样品粉末与缓冲液迅速搅匀使之不成团，65℃水浴30分钟，其间轻摇3-5次；4℃，8000rpm离心，取上清液转入1.5m1离心管，加入等体积氯仿-异戊醇（24 :1）混匀；室温，10000rpm离心10min，取上清液；加2／3体积的预冷异丙醇，-20℃沉淀30min；4℃ 10000rpm离心5min，弃上清，加入500μl 70%乙醇洗2次，吸干上清液，室温晾干，约10分钟；加入200μl 已灭菌的的TE溶液（pH8.0），混匀后，即得DNA溶液，置于-20℃保存备用；

PCR扩增反应：

PCR反应体系为10μl，其中包括基因组DNA 30 ng，2.5 mmol·L-1 MgCl₂， dNTPs各0.2mmol·L-1，引物0.5μmol·L-1，0.3U Taq DNA聚合酶；

PCR反应程序：

首先94℃ 3min；然后94℃ 30s，46℃ 30s，72℃ 30s，共30个循环；最后72℃ 10 min；PCR扩增反应在PCR基因扩增仪上进行；

凝胶电泳：

扩增产物在质量体积比浓度为8%的垂直板变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上进行电泳，恒功率80W电泳，电泳结束后，将胶版置于固定液中固定20min，蒸馏水冲洗3次，每次至少2分钟，银染30min，显色后加入固定液固定，再用蒸馏水洗涤凝胶2次，每次至少2分钟，然后晾干，将晾干的玻璃板置于灯箱上观察结果或照相记录。