[发明专利]抗支原体的ST细胞，和用此细胞培养猪瘟病毒弱毒株及制备猪瘟弱毒疫苗的方法

说明书

发明所属领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，本发明涉及抗支原体细胞，制备该细胞的方法及用该细胞培养猪瘟病毒弱毒株及制备猪瘟弱毒疫苗的方法。

背景技术

用ST细胞培养猪瘟病毒弱毒株是猪瘟病毒研究工作中的常用技术之一；以此技术为基础生产猪瘟弱毒活疫苗，正在成为目前国内猪瘟疫苗生产的新趋势。但是，在细胞与病毒培养环节，支原体污染是一个普遍存在且极难解决的问题。细胞中的支原体污染将严重影响研究结果，对病毒疫苗如猪瘟弱毒疫苗，支原体污染将意味着产品质量不合格，存在重大生物安全隐患。（任杰  《中国畜牧兽医》  2008年第35卷第10期  39-42；赵俊等  动物细胞培养物中支原体污染的检测  《安徽农业科学》。2010，38(3)：1151—1153；刘玉琴等  体外培养细胞工作中支原体污染及对策  《中华病理学杂志》2004年12月第33卷第6期Chin J Pathol，December 2004，Vol 33 No．6）

常用于控制与清除培养过程支原体污染的方法主要有如下两种：1、严格控制培养环境与操作过程，防止支原体混入培养体系；2、用四环素类及内环酯类抗生素等药物按一定的浓度与程序添加于培养液中，使其杀灭或抑制培养物中已污染或可能污染的支原体。这2种方法都有其严重缺陷：前者对培养环境的要求极其严格，目前我国普遍使用的培养设备条件无法杜绝环境中支原体的存在或引入，这也使得操作人员长期处于技术高压状态，稍有不慎就可能造成整批培养物全部废弃。据统计，目前用牛睾丸原代细胞生产猪瘟弱毒疫苗的工艺，约有30%的培养物在产品收获前因支原体污染被全部废弃，用常规ST细胞系生产猪瘟疫苗，其培养过程被支原体污染的概率与此基本相当。而后者由于所使用的药物在杀灭或抑制支原体的同时对细胞会产生较强的毒性，特别是导致疫苗内存在抗生素残留，因此使用这类药物控制支原体污染时，只能采取低浓度、长时间逐步筛选，这种方法不仅效率低，耗时长，而且支原体污染的可能性依然存在。（刘岚贴壁细胞培养过程中支原体污染的几种救治方案疗效比较研究《现代医药卫生》2008年24卷第8期；申请专利号 200610048802 一种防控细胞培养污染的产品）。

防御素是一类天然存在于动物体内的多肽类物质，具有广谱抗感染功能，是动物体内防御屏障之一，许多研究证明：将表达该类物质的基因转染到多种体外培养物的基因组中，这些转基因培养物可以表达该类物质或增加该类物质的表达量（罗刚  猪防御素基因PBD-I在大肠杆菌中的重组和融合表达  《遗传》25(2)：146～150，200）。目前已有的研究工作将PBD-1基因转染到Marc145、BHK21等细胞系中获得具有抗支原体污染、且可培养一些病毒的细胞，但是这些细胞对猪瘟病毒弱毒株不敏感，无法应用于猪瘟病毒弱毒株的大量扩增并制备猪瘟弱毒疫苗。

发明技术内容

本发明的一个目的是提供一种新的抗支原体污染的ST细胞，该细胞对猪瘟病毒弱毒株敏感，能用于猪瘟病毒弱毒株疫苗制备，能分泌β防御素，可有效预防细胞培养和病毒扩增中支原体污染。

本发明的另一个目的是提供一种制备抗支原体污染的ST细胞系的方法。

本发明的再一个目的是提供新的抗支原体污染的ST细胞在培养猪瘟病毒弱毒株和制备猪瘟弱毒疫苗中的应用.

本发明的再一个目的是提供利用获得的抗支原体污染的ST细胞系培养猪瘟病毒弱毒的方法。

本发明的再一个目的是提供利用获得的抗支原体污染的ST细胞系制备猪瘟弱毒疫苗的。

本发明公开了一个新的抗支原体污染的ST细胞系，其特征在于, 该细胞人工转入了猪PBD-1基因，且转入的猪PBD-1基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，该细胞命名为“PBD-1/ST细胞”，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201196。PBD-1/ST细胞是将猪PBD-1基因导入猪睾丸细胞系ST并经G418与单个细胞克隆培养法交替筛选获得。该细胞还有如下特征：PBD-1/ST细胞对猪瘟病毒弱毒株敏感，可高滴度培养猪瘟病毒弱毒株，可产生猪β-防御素-1，能有效预防培养过程中的支原体污染。

本发明还公开了制备抗支原体污染的ST细胞的方法，该方法包括如下步骤：

1)      基因扩增：以猪肝脏组织总RNA为模板，用RT-PCR技术扩增猪PBD-1基因；

2)      质粒构建：将扩增的PBD-1基因片段经酶切，连接至pIRES2-EGFP上，并转化大肠杆菌DH5α，筛选获得含PBD-1基因的质粒；