[发明专利]一种检测登革病毒抗体的重组抗原蛋白、试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种检测登革病毒抗体的重组抗原蛋白，其特征在于：所述重组抗原蛋白包括具有如SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的Den-Ag5，所述Den-Ag5的编码基因序列具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的检测登革病毒抗体的重组抗原蛋白，其特征在于：所述重组抗原蛋白还包括具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的Den-Ag1和/或具有SEQ ID NO.4所示氨基酸序列Den-Ag2；所述Den-Ag1的编码基因序列具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述Den-Ag2的编码基因序列具有如SEQID NO.3所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的检测登革病毒抗体的重组抗原蛋白，其特征在于：所述重组抗原蛋白为Den-Ag5、Den-Ag1、Den-Ag2等量混合而成。

4.一种检测登革病毒抗体的重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

一、选择登革病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段包含如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠；

二、设计PCR扩增引物，并通过PCR扩增所述目的基因片段；

三、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒；

四、将所述重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养所述表达宿主细胞使其产生重组抗原蛋白，并通过纯化获取重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQ ID NO.6所示氨基酸序列。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述目的基因片段还包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的Den-Ag1；如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列编码具有如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的Den-Ag2。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中采用的PCR扩增引物序列如下：

扩增SEQ ID NO.1核苷酸序列的引物：

正向引物：CGGAATTCGTAGAAGGGGTTTCAGGAGGA<SEQ ID NO.7>

反向引物：ACGTGTCGACCTAACCAACACAACAACAGAAT<SEQ ID NO.8>；

扩增SEQ ID NO.3核苷酸序列的引物：

正向引物：CGGAATTCAACATCTTGAATAGGAGACGCAGAT<SEQ ID NO.9>，

反向引物：ACGTGTCGACTGTCAGTAGGATGAAAATCAG<SEQ ID NO.10>；

扩增SEQ ID NO.5核苷酸序列的引物：

正向引物：CGGGATCCGGGGTCTTAGAGCAAGGGAA<SEQ ID NO.11>，

反向引物：ACGCAAGCTTTGCTCTTGAGGCACTTGGAC<SEQ ID NO.12>。

7.一种登革病毒的检测试剂盒，包括抗体检测板和ELISA反应液，其特征在于：所述抗体检测板上包被有检测登革病毒抗体的重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白为权利要求1-3中任意一项中所述的重组抗原蛋白。

8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，试剂盒中ELISA反应液包括：酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，酶结合物工作液，阳性对照为登革病毒抗体标准品，阴性对照为登革病毒抗体阴性血清，所述酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的抗人IgG。