[发明专利]一种获得造血干细胞的方法

权利要求书

1.一种获得造血干细胞的方法，通过以下技术方案实现：

（1）细胞制备：取骨髓，密度梯度离心结合贴壁筛选法，获得单个核细胞，选择生长状态良好的单个核细胞，用于诱导性多能干细胞的制备；

获取胎鼠成纤维细胞，选择生长状态良好的胎鼠成纤维细胞，丝裂霉素C处理，作为制备诱导性多能干细胞的饲养层；

（2）诱导性多能干细胞制备

利用含有四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的病毒转染生长状态良好的单个核细胞；病毒包装利用脂质体2000转染试剂盒转染293T 细胞进行，孵育24-72小时，收集病毒和病毒滴度测定，选择生长良好的单个核细胞，将含有四种转录因子的病毒按照1：5比例加入培养系统中，进行病毒转染，病毒转染24小时后，将病毒转染过的目的细胞转到处理好的鼠胚胎成纤维细胞中，第二天将培养基更换为胚胎干细胞的培养基，待克隆形成，挑选形态上类似胚胎干细胞的克隆进行扩大培养并进行诱导性多能干细胞生物学特征检测，对于符合诱导性多能干细胞生物学特征的克隆，被确定为诱导性多能干细胞，继续向造血干细胞进行分化；

（3）分化获得造血干细胞

根据诱导因子功能的不同，分成四组，分阶段高效诱导诱导性多能干细胞为造血干细胞，并检测获得的造血干细胞向造血细胞和内皮细胞方向分化的潜能；

第一组诱导因子有中胚层诱导因子BMP-4、PD98059和部分早期造血因子SCF、Flt3L、 VEGF，第二组细胞因子为造血因子和促进造血干细胞增值的细胞因子SCF、Flt3L、 VEGF、IL-3、IL-6，第三组细胞因子为刺激造血干细胞在半固体培养基中形成不同细胞集落和不同造血细胞的因子，有SCF、VEGF、IL-3、IL-6 、TPO、 EPO 、G-CSF、GM-CSF，第四组为刺激造血干细胞向内皮细胞分化的VEGF-A；

第一组细胞因子BMP4、PD98059、SCF、Flt3L、VEGF处理后收集的拟胚体中，含有高比例的中胚层转录因子Brachyury 和GATA-2；

将第一组细胞因子处理后收集的拟胚体分散成单细胞悬液，种植在低粘附的培养皿中，培养基为含有SCF、Flt3L、VEGF、bFGF、IL-3、IL-6、L-谷氨酰胺、b-巯基乙醇、非必须氨基酸的造血干细胞培养基StemPro-34，处理7-9天后获得高达19.58±4.37%的造血干细胞。

2.根据权利要求1所述的一种获得造血能干细胞的方法，其特征在于，利用成分确定的诱导因子的方法将来源于骨髓单个核细胞重编程的诱导性多能干细胞高效分化成造血干细胞。

3.根据权利要求1所述的一种获得造血能干细胞的方法，其特征在于，获得的造血干细胞在SCF、VEGF、IL-3、IL-6 、TPO、 EPO 、G-CSF、GM-CSF因子作用下，形成造血集落，为红系集落,粒系集落,巨核系集落,红系/粒系/巨核系/巨噬系集落。

4.根据权利要求1所述的一种获得造血能干细胞的方法，其特征在于，获得的造血干细胞能表达内皮细胞特有的标记蛋白CD31 和 VE-CADHERIN；获得的造血干细胞在VEGF-A和matrigel作用下，形成血管状组织结构。