[发明专利]一种制备大豆复合型外植体的方法及用该外植体制备快速转基因大豆植株的方法

权利要求书

1.一种制备大豆复合型外植体的方法，其特征在于是将成熟大豆种子消毒，无菌条件下在萌发培养基中光照培养催芽，催芽24h后，从种子眼处去掉种皮，去掉胚尖两侧的第一片真叶，去掉一片子叶，保留包括胚根的完整下胚轴、胚尖及另一片子叶，即为所述大豆复合型外植体；

所述萌发培养基成分为30g/L蔗糖和质量百分浓度为0.8 %的琼脂，pH 5.8。

2.根据权利要求1所述制备大豆复合型外植体的方法，其特征在于所述消毒是在含有氯气的密闭容器内熏蒸消毒4~6h。

3.一种制备快速转基因大豆植株的方法，其特征在于步骤如下：

（1）制备大豆复合型外植体：用权利要求1或2所述方法制备大豆复合型外植体，将该外植体胚尖朝上垂直播种预培养基中，预培养24~28h；

（2）携带目的基因的农杆菌转化外植体：将携带外源目的基因的农杆菌在YEB液体培养基中扩大培养，培养液离心，收集沉淀，用共培养基稀释成OD₆₀₀=1.5的菌液，将步骤（1）中预培养后的大豆复合型外植体转移到菌液中，28℃黑暗环境侵染19~23h；

（3）大豆复合型外植体芽诱导：取出侵染后的大豆外植体，置于铺有无菌滤纸的固体共培养基上，28℃黑暗培养3~7d，再取出，用无菌水洗去附着在其表面的农杆菌，无菌滤纸吸干表面附着的液体，转到芽诱导培养基培养2~3周，每周转接一次，培养至外植体长出不定芽；

（5）生根培养及炼苗：将芽诱导培养基上的外植体不定芽转到生根培养基生根培养，根健壮时敞开瓶口炼苗2~3d，移入培养土中，待幼苗长出两片新叶后，再移栽到温室中；

所述预培养基成分：MSB5，1.0 mg/L 6-BA，30g/L蔗糖，质量百分浓度为0.8 %的琼脂，pH 5.8；

所述YEB液体培养基成分：10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5g/L NaCl，pH 5.8；

所述共培养基成分：1/2MSB5，30 g/L葡萄糖，6.0 mg/L BA，0.5 g/L MES，200 μmol/L 乙酰丁香酮，pH5.8；

所述固体共培养基成分：1/2MSB5，30 g/L葡萄糖，6.0 mg/L BA，0.5 g/L MES，200μmol/L 乙酰丁香酮，0.4%琼脂，pH 5.8；

所述芽诱导培养基成分：1/2MSB5，0.2 mg/L 6-BA，0.2 mg/L IBA，300 mg/L头孢霉素，1.25mg/L PPT，0.8％琼脂，pH5.6；

所述生根培养基：1/2MSB5，20g/L蔗糖，1.0mg/L IBA，250mg/L 头孢霉素，0.25mg/L  PPT， 0.7％琼脂，pH5.6。

4.根据权利要求3所述制备快速转基因大豆植株的方法，其特征在于步骤（2）中携带外源目的基因的农杆菌菌株是EHA105，外源目的基因为抗冷冻蛋白基因afp，该农杆菌还包括bar除草剂抗性基因作为筛选标记。

5.根据权利要求4所述制备快速转基因大豆植株的方法，其特征在于步骤（2）中携带外源目的基因的农杆菌菌株由以下方法制备：

（1）构建外源目的基因表达载体：构建表达载体pCAAFP66，该表达载体含有35S启动子、afp抗冷冻蛋白基因和bar除草剂抗性筛选标记基因；

（2）外源目的基因转化农杆菌：用热激法把载体pCAAFP66转到农杆菌EHA105菌株中，置-80℃保存备用；

（3）筛选：取保存的菌株，在加入抗生素的YEP固体培养基上划平板，培养48h，挑取单菌落接种到含有相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃、220 r/min培养24 h，即得携带目的基因的农杆菌菌株；

所述抗生素为壮观霉素、链霉素和卡那霉素中的一种或几种；

所述YEP固体培养基成分为：10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5g/L NaCl，质量百分浓度为6%的琼脂，pH 5.8。