[发明专利]表达乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的重组BHK细胞系及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及重组哺乳动物表达细胞系，具体地，本发明涉及一种表达乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白重组BHK细胞系，更具体地，重组BHK细胞系是BHK-JEV-ME，其菌种保藏编号为：CGMCC No.5263。本发明还公开了制备所述重组BHK细胞系的方法和该重组细胞系在制备预防乙型脑炎疫苗中的应用。属于生物医药基因工程与免疫学领域。

背景技术

乙型脑炎又称流行性乙型脑炎或日本乙型脑炎，是由乙型脑炎病毒引起的，侵害中枢神经系统的病毒性人兽共患性传染病。

流行性乙型脑炎(Epidemic Encephalitis B)又称日本乙型脑炎(Japanese BEncephalitis)，简称乙型脑炎。乙型脑炎是由乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus，JEV)引起的一种重要蚊媒性人兽共患传染病。多种动物易感，但通常只有人、马和猪感染后会呈现临床症状。人尤其是儿童对乙脑病毒易感，感染后临床症状主要表现为发烧、剧烈头痛、恶心、呕吐、嗜睡不醒等，重者可出现抽搐、昏迷，甚至出现呼吸衰竭而死亡。马属动物特别是幼驹易感，但多数呈隐性感染，少数出现神经症状，死亡率低，是终末宿主。猪是乙型脑炎病毒在自然界最重要的扩增动物。怀孕母猪感染可导致死产和其他繁殖障碍，感染的公猪显示睾丸急性炎症。此病的地理分布主要在亚洲东部和亚洲南部，俄罗斯东部和太平洋岛屿等诸国也有报道。在世界范围内，每年约有35,000至50,000人感染发病，约有10,000例死亡病例。对人畜的健康造成严重的威胁。由于疫苗的成功应用，乙型脑炎在我国已经得到较好的控制，但近年来发病率有所上升，少数地区还有重要的疫情流行发生，如2006年山西运城市发生严重的乙脑疫情。

采用疫苗进行预防接种是控制该病流行的有效措施。目前国际上认可的乙型脑炎疫苗有乙型脑炎病毒中山株的鼠脑组织灭活疫苗，该疫苗价格较贵，免疫持续期不稳定，且有免疫接种副反应，安全性不是很好。其它疫苗还有包括用Vero细胞生产的灭活疫苗，我国科研人员培育的乙型脑炎病毒减毒株(SA14-14-2株)制成的乙型脑炎病毒减毒活疫苗，但该疫苗的生物安全性和生产工艺等还没有得到国际标准的认可，从而限制了该疫苗在乙脑流行的其它国家的应用。所以研制新型乙型脑炎疫苗势在必行。基因工程疫苗是乙型脑炎疫苗新的发展方向。乙型脑炎病毒表面囊膜糖蛋白E蛋白是该病毒诱导保护性免疫反应的主要蛋白。M蛋白在病毒诱导机体产生免疫保护中也起着得要作用。病毒样颗粒(VLP)疫苗是新型基因工程疫苗，VLP具有与病毒粒子本身一样的空间结构，能产生与真实病毒一样的免疫保护效果，但VLP为复制缺陷型，不含核酸，所以不存在毒力与致病等风险。VLP与常规疫苗相比较更为有效，安全，是今后基因工程疫苗发展的重要方向。

乙型脑炎病毒属黄病毒科黄病毒属，为单链正义RNA病毒，病毒基因组长约11kb。整个基因组由5’端非编码区(5’-NCR)、一个大的开放阅读框(ORF)及3’端非编码区(3’-NCR)构成，无亚基因组结构。ORF大小约为10.3kb，编码一个多聚蛋白前体，经切割加工，产生3个结构蛋白：核心蛋白(C)、膜蛋白(prM/M)和囊膜糖蛋白(E)；7个非结构蛋白(NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b，NS5)。不同毒株的JEV常在毒力与血凝特性上有明显的差异，但没有明显的抗原性差异，即抗原变异不显著。而且JEV感染或免疫可产生坚强的持久免疫力，迄今没有见到临床病例在痊愈后第二次感染发病的报道。这些特点为乙型脑炎的免疫预防提供了良好的基础。在JEV编码的3个结构蛋白和7个非结构蛋白中，与机体的免疫保护反应相关的蛋白主要是E蛋白和NS1蛋白。其中E蛋白的免疫保护机制主要是诱导机体产生病毒中和抗体。

E蛋白是病毒粒子表面最重要的结构蛋白，其表面的抗原决定簇，具有血凝活性和中和活性。E蛋白与病毒的毒力、宿主范围、组织嗜性、膜融合、保护性免疫、血凝反应和血清特异性有关。E蛋白是乙型脑炎病毒最重要的免疫保护性抗原，它能诱导机体产生病毒中和活性抗体。研究表明，基因工程表达的E蛋白，重组病毒表达的E蛋白以及包含E蛋白基因的DNA疫苗都具有很好的免疫保护作用。而且这种免疫保护作用主要是通过诱导产生病毒中和抗体而发挥作用的。