[发明专利]一种分离纯化利卡灵B的方法

说明书

技术领域

本发明属于天然药物领域，具体涉及一种分离纯化利卡灵B的方法。

背景技术

利卡灵B（Licarin B）分子式为C₂₀H₂₀O₄，分子量为324.38，为无色针晶，mp.91-92℃（甲醇）。是从ongoing樟科（Lauraceae）植物中分离得到的一种木脂素类化合物，如李卡樟Licarin aritu Ducke树干、日本润楠Machilus japonica Sieb.et Zucc.叶以及红楠Machilus thunbergii Sieb.et Zucc.树皮、木材和叶。药理研究表明，利卡灵B具有免疫抑制活性，对促细胞分裂剂（刀豆球蛋白A）诱导的人外周血液淋巴细胞增生有抑制作用，其IC₅₀为1.25μg/mL。迄今为止，尚未发现大量分离纯化利卡灵B的方法报道，亦没有采用酶法和高速逆流色谱法分离纯化利卡灵B的工艺报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离纯化利卡灵B的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种分离纯化利卡灵B的方法，其特征在于包括以下步骤：取原料李卡樟树干经粉碎处理后，用酶溶液水浴浸泡4-12小时，充分搅拌、过滤，取滤渣用5-10倍量的95%乙醇回流提取2-3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏，用正丁醇萃取得萃取物，再以正己烷-甲醇-乙腈-水为溶剂系统，采用高速逆流色谱分法分离萃取物，流分减压浓缩，乙醇重结晶即得利卡灵B。

所述酶溶液为纤维素酶溶液或果胶酶溶液，酶含量为0.4-0.8%，酶溶液pH为4.0-4.5，酶解温度为35-45℃。

所述高速逆流色谱溶剂系统正己烷-甲醇-乙腈-水体积比为（4-8）：（3-6）：（1-3）：（2-5）。

本发明的有益效果在于采用酶法提取，使有效成分更易溶出，可提高提取率；采用高速逆流色谱法分离纯化，具有分离效果好，高效、快速、产品纯度高等特点。

具体实施方式

实施例1：

取原料李卡樟树干经粉碎过60目筛后，称取2kg加6LpH4.2的纤维素酶溶液（纤维素酶加入量为药材量的0.4%）于40℃水浴浸泡酶解8小时，充分搅拌、过滤，取滤渣用6倍量的95%乙醇回流提取2次，合并提取液，减压浓缩得浸膏，用正丁醇萃取得萃取物，再以正己烷-甲醇-乙腈-水为溶剂系统，按体积比为5:3:2:4配制，将溶剂系统置于分液漏斗中振摇，静置，分出上相和下相，上相为固定相，下相为流动相，用下相溶解萃取物，将固定相泵入色谱柱中，使柱中充满，再启动主机转动，控制转速为850r/min，同时以2ml/min流速泵入流动相，待两相达到动态平衡后，进样，紫外检测，收集流出液，旋转蒸发浓缩，乙醇重结晶，干燥得4.87g利卡灵B产品，含量98.6%。

实施例2：

取原料李卡樟树干经粉碎过60目筛后，称取2kg加8LpH4.4的纤维素酶溶液（纤维素酶加入量为药材量的0.5%）于38℃水浴浸泡酶解4小时，充分搅拌、过滤，取滤渣用5倍量的95%乙醇回流提取3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏，用正丁醇萃取得萃取物，再以正己烷-甲醇-乙腈-水为溶剂系统，按体积比为7:5:3:2配制，将溶剂系统置于分液漏斗中振摇，静置，分出上相和下相，上相为固定相，下相为流动相，用下相溶解萃取物，将固定相泵入色谱柱中，使柱中充满，再启动主机转动，控制转速为850r/min，同时以2ml/min流速泵入流动相，待两相达到动态平衡后，进样，紫外检测，收集流出液，旋转蒸发浓缩，乙醇重结晶，干燥得4.76g利卡灵B产品，含量97.3%。

实施例3：

取原料李卡樟树干经粉碎过60目筛后，称取2kg加10LpH4.0的纤维素酶溶液（纤维素酶加入量为药材量的0.8%）于35℃水浴浸泡酶解10小时，充分搅拌、过滤，取滤渣用8倍量的95%乙醇回流提取3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏，用正丁醇萃取得萃取物，再以正己烷-甲醇-乙腈-水为溶剂系统，按体积比为4:6:1:5配制，将溶剂系统置于分液漏斗中振摇，静置，分出上相和下相，上相为固定相，下相为流动相，用下相溶解萃取物，将固定相泵入色谱柱中，使柱中充满，再启动主机转动，控制转速为850r/min，同时以2ml/min流速泵入流动相，待两相达到动态平衡后，进样，紫外检测，收集流出液，旋转蒸发浓缩，乙醇重结晶，干燥得4.64g利卡灵B产品，含量98.7%。

实施例4：

取原料李卡樟树干经粉碎过60目筛后，称取2kg加7LpH4.5的纤维素酶溶液（纤维素酶加入量为药材量的0.6%）于45℃水浴浸泡酶解12小时，充分搅拌、过滤，取滤渣用10倍量的95%乙醇回流提取2次，合并提取液，减压浓缩得浸膏，用正丁醇萃取得萃取物，再以正己烷-甲醇-乙腈-水为溶剂系统，按体积比为8:3:3:5配制，将溶剂系统置于分液漏斗中振摇，静置，分出上相和下相，上相为固定相，下相为流动相，用下相溶解萃取物，将固定相泵入色谱柱中，使柱中充满，再启动主机转动，控制转速为850r/min，同时以2ml/min流速泵入流动相，待两相达到动态平衡后，进样，紫外检测，收集流出液，旋转蒸发浓缩，乙醇重结晶，干燥得4.92g利卡灵B产品，含量98.1%。