[发明专利]融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素的重组杆状病毒及其亚单位疫苗

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素SS的重组杆状病毒及重组亚单位疫苗。 

技术背景

杆状病毒表达系统是目前比较成熟的表达系统之一，具有安全无毒，外源表达量高，可以对蛋白进行翻译后修饰等优点，已经成功用于多种蛋白的生产和疫苗的制备。而Cap蛋白是由猪圆环病毒2型PCV2的ORF2编码的大约30kD的衣壳蛋白，包含多个抗原表位和中和抗原表位，已被公认为是PCV2主要的免疫保护性抗原。国外已有用杆状病毒系统表达Cap制备的商品化疫苗上市使用，并经临床证明安全有效。生长抑素(SS)是十四个氨基酸的小肽，与下丘脑生长激素释放因子(GHRF)共同调节生长激素(GH)的释放，已有研究报道证实通过与载体蛋白融合，主动免疫动物，可使机体产生针对SS抗体，中和体内SS，解除SS的抑制作用，促进动物的生长。本研究将SS与PCV2 Cap融合在杆状病毒系统中表达，以期开发一种既可防控PCV2又能促进猪体生长的新型亚单位疫苗。 

发明内容

本发明的目的是提供一种融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素的重组杆状病毒。 

本发明的另一目的是提供一种能够有效预防控制PCV2相关疾病的亚单位疫苗，有效防控PCV2相关疾病。 

本发明的实施方案如下： 

融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素SS的重组杆状病毒rAc-Cap-SS，该重组杆状病毒带有猪圆环病毒2型Cap蛋白基因开放阅读框和生长抑素SS基因形成的融合基因ORF2-SS。 

其中，所述的融合基因ORF2-SS序列如SEQ ID NO.1所示。 

所述的融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素SS的重组杆状病毒保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2010年12月17日，保藏号：CGMCC No.4459的。该重组杆状病毒rAc-Cap-SS在分类上属于：苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，该重组杆状病毒可以对目的蛋白进行有效的表达，表达的目的蛋白含量较高，免疫原性较好，并可形 成病毒样颗粒，可用于制备新型PCV2亚单位疫苗和仔猪促生长亚单位疫苗。 

本发明重组杆状病毒是通过以下方法构建而成的： 

(1)ORF2-SS基因的扩增、克隆根据PCV2毒株SH(AY686763)的序列设计扩增Cap蛋白基因特异性引物以及引入SS基因的引物，引物序列如下： 

P1：5’CTTGGATCCATGACGTATCCAAGGAG-3’(SEQ ID NO.2) 

PCV2SS1：5’-CTTCCAGAAGAAGTTCTTGCAGCCAGCCATCTTAGGGTTAAGTGGG-3’(SEQ ID NO.3) 

PCV2SS2：5’-ATACTCGAGTTACTAACAGGATGTGAAAGTCTTCCAGAAGAAGTTCTTGC-3’(SEQ ID NO.4) 

采用常规方法提取PCV2病毒DNA，应用PCR技术分两次扩增得到引入SS基因的ORF2-SS基因片段，通过BamH I/Xho I酶切位点，将ORF2-SS基因克隆入供体质粒pFastBac^TMHTB中，通过PCR和酶切鉴定，阳性质粒进一步经测序鉴定，获得阳性重组质粒pF-Cap-SS。 

(2)转化DH10Bac感受态大肠杆菌参照Bac-to-Bac表达系统说明书的方法将鉴定好的pF-Cap-SS转化入DH10Bac感受态大肠杆菌，在Helper质粒的辅助作用下，重组质粒pF-Cap-SS和杆状病毒骨架载体Bacmid之间发生同源重组，实现了把外源基因转入杆状病毒骨架载体，经两次蓝白菌落筛选，挑取白色菌落培养，提取重组Bacmid质粒，分别利用M13F和PCV2SS2以及P1和M13R进行PCR鉴定，获得含ORF2-SS基因的重组Bacmid质粒rBac-Cap-SS。 

(3)重组杆状病毒的获得鉴定好的rBac-Cap-SS通过转染Sf9细胞，重组质粒在Sf9细胞内包装成完整的重组杆状病毒rAc-Cap-SS。 

本发明所述的重组杆状病毒rAc-Cap-SS在制备猪圆环病毒2型疫苗中的应用。 

所述的重组杆状病毒rAc-Cap-SS优选保藏号为CGMCC No.4459的重组杆状病毒。