[发明专利]实时监测溶液中病毒颗粒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种实时监测溶液中病毒颗粒的方法。

背景技术

病毒在众多微生物中个体最小、结构特殊、致病性强。广泛存在于空气，水，土壤以及人体血液，体液，粪便中，对公共卫生造成极大威胁。以水环境为例，目前已发现的700多种介水传播病毒中，轮状病毒、肝炎病毒和肠道病毒占主导，可引起腹泻、肝炎等多种病症。其中，轮状病毒每年导致114亿例腹泻，在发展中国家每年导致87万例死亡[Albert，M.J.，et al.，Bangladesh.Journal of clinical microbiology，1999.37(11)：p.3458]。A型和E型肝炎病毒的传染通常与不合格供应的水有关，E型肝炎在孕妇中尤其严重，其死亡率高达25％[Aggarwal，R.andK.Krawczynski，Jou rnal of gastroenterology and hepatology，2000.15(1)：p.9-20]。2004年，我国四川省因饮用水污染暴发传染病流行，123名学生罹患甲肝[任金法.中国卫生检验杂志，2009(004)：p.942-944]。由此可见，病毒对人体危害巨大，污染水源会对公共卫生造成极大威胁。而存在于血液中的肝炎病毒，HIV病毒等，以及存在于空气中的流感病毒，风疹病毒等同样会对人的健康造成影响。为了保障环境及人体的卫生安全，实时检测各类环境中的病毒的方法及小型便携设备成为临床和日常生活中的迫切需求。

目前临床常用的病毒检测方法包括：电镜观察，电泳分离以及间接酶联免疫法(ELISA)，分别从病毒颗粒的大小形态，电荷性质和表面特异性识别方面对病毒的种类、特点进行检测和鉴定。然而这些方法都必须在实验室条件下进行，且耗时较长，未能实现实时检测，技术流程较为复杂，很难进行临床推广。因此，一种高灵敏度实时检测环境中病毒的方法和便携设备亟待开发。纳米孔技术，作为新一代单分子检测的热点，同样可以在高灵敏度病毒检测方面得到出色的应用。

在1996年Kasianowicz及其同事首次报道[Kasianowicz，J.J.，et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1996.93(24)：p.13770-13773]了单链DNA或RNA在电场作用下通过α-溶血素纳米孔，并且得到分子通过孔时产生了阻塞电流(blockade current)的现象，可以依次获得每一个碱基通过纳米孔时阻塞电流幅度。由于不同的碱基产生的阻塞电流都有相应的降低幅度，根据这个可以区分出四种碱基，以获得了DNA或者RNA分子的序列成分。另外还可以通过阻塞电流持续的时间推算出阻塞整个分子的长度。经过近几十年的不断的努力，纳米孔作为单分子检测的方法研究日益升温，最主要的原因就是这种方法具有方便、快速、廉价等优点。

发明内容

本发明提供一种实时监测溶液中病毒颗粒的方法，可以实现快速检测病毒颗粒。

申请人经研究发现，在病毒检测中，病毒颗粒的粒径大小，形状同样可以通过对阻塞电流大小，信号持续时间的分析得到；此外，孔壁的特异性抗体修饰还能够实现特定病毒种类的定向捕获，从而与其他颗粒区别开来。与传统的电镜观察，电泳分离以及间接酶联免疫法(ELISA)相比具有检测速度快，操作便捷，灵敏度高等特点，是一种极具吸引力的病毒检测方法。通过这种方法，原理上可以实现快速检测病毒颗粒，通过病毒颗粒通过纳米孔时形成阻塞电流的幅值和持续时间，分辨其种类，数量和状态。

所述实时监测溶液中病毒颗粒的方法为，在偏置电压作用下，使包含病毒颗粒的样品溶液通过纳米孔，检测电信号，通过与包含标准病毒的溶液通过纳米孔时获得的电信号相比，确定样品溶液中包含病毒颗粒的信息。所述病毒颗粒优选为轮状病毒、乙型肝炎病毒或人类疱疹病毒。

优选，通过与包含标准病毒的溶液通过纳米孔时获得的电信号的幅度、持续时间、时间分布、频率、电信号波形特性或相位特性中的至少一种相比，确定样品溶液中包含病毒颗粒的信息。

优选，所述纳米孔尺寸为100-250nm。更优选，所述纳米孔经偶联剂分子、DNA单链或双链分子、RNA分子、PNA分子或蛋白质分子表面修饰。

作为本发明的改进，所述包含病毒颗粒的样品溶液通过纳米孔之前，通过亚微米级滤器进行预处理，滤去细菌及其他大颗粒杂质。