[发明专利]从膨胀液中分离脂肪间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种从膨胀液中分离脂肪间充质干细胞的方法，由以下步骤组成：

（1）膨胀液的收集     抽脂前向所要抽取部位灌注过量低渗膨胀液，然后将抽脂过程中获取的脂肪与膨胀液置于室温下放置10min，待脂肪与膨胀液完全分离后，用移液枪吸取黄色脂肪下面部分的红色液体，即为含有脂肪干细胞的膨胀液。

2. （2）膨胀液的处理     将收集到的膨胀液分装入50ml离心管，放入离心机以1500rpm离心5min。

3.离心吸取弃掉离心管上面部分的液体，收集沉淀，每管用PBS液悬浮，加入红细胞裂解液室温静置5分钟，以1200rpm离心3min，弃上清液； （3）细胞的洗涤     加入5ml DMEM（不含血清）将沉淀吹散，细胞滤器过滤，过滤以后的液体以1200rpm离心3min，沉淀即为要获取的脂肪间充质干细胞，再加入DMEM（不含血清）重复以上的操作洗涤3次；

（4）细胞培养

将获取细胞接种至75cm²细胞培养瓶内，接种，加入间充质干细胞培养基，37℃，5%CO₂培养；

（5）细胞鉴定

对分离培养的细胞与脂肪来源干细胞进行形态学、免疫表型鉴定并进行比较。

4.（6）对膨胀液来源脂肪干细胞进行成脂、成骨和成软骨三向分化潜能鉴定。

5.如权利要求1所述的方法，其中步骤1所述的膨胀液是在1000ml生理盐水中加入20ml利多卡因和1ml肾上腺素制备得到的。

6.如权利要求1所述的方法，其中步骤2所述 PBS液的加入量为3 ml，红细胞裂解液加入的体积量为沉淀和PBS液总体积的1-2倍。

7.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中步骤4所述的接种密度为5000个/cm²，间充质干细胞培养基的加入量为10 ml。

8.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中步骤5所述的免疫表型鉴定是指对CD73, CD90, CD105和CD45,CD34, CD14, CD11b, CD19 , HLA-DR进行检测。

9.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中步骤6所述分化潜能鉴定是对分离细胞进行成脂、成骨和成软骨三向诱导分化，染色观察分化效果。