[发明专利]一种测定待检测样本中疾病相关核酸分子的核苷酸序列的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种测定待检测样本中疾病相关核酸分子的核苷酸序列的方法。所述方法包括：设计具有多种疾病特异性探针芯片、对带有接头的特异性目的DNA片段进行捕获和富集、高通量测序、分析基因突变位信息等步骤。

背景技术

各种模式生物基因组测序工作的完成，极大地提高了人们在基因水平对疾病致病机理和机体生理状态的认识，也极大地促进了第二代高通量测序技术的发展。目前完成基因组组测序的生物有：人、小鼠、大鼠、果蝇、水稻、大豆、拟南芥等。然后由于受到测序成本的限制，对个体进行基因组测序和疾病相关基因的鉴定和分析远不能满足日益发展的需要。

单基因病是由一对等位基因控制的疾病或病理性状，又称孟德尔遗传病或单基因遗传病。目前已经发现的单基因病有6000多种，其中表形已知而分子基础未知的疾病有1700多种，而由于遗传异质性，表型和致病分子基础已知(约2900多种)的单基因病中，还有很多的亚型未被发现。基因是位于染色体上的遗传单位，染色体有常染色体和性染色体之分，基因也有显性基因与隐性基因之别，因此位于不同染色体上的致病基因具有不同的遗传方式。通常，单基因病可分为常染色体显性遗传病、常染色体隐性遗传病、x伴性显性遗传病、x伴性隐性遗传病、Y伴性遗传病等几类。

单基因病的检测方法目前主要基于第一代测序技术，主要为以下几种：系谱分析、染色体核型分析、酶促反应及活性测定、RALF、SSCP(单链构象多态性)、MOLDI-TOF、FISH(荧光原位杂交)、a-CGH(a-比较基因组杂交)、qPCR、MLPA(多重连接探针扩增)、Sanger法等。上述方法中存在诸多缺点，比如：系谱分析、染色体核型分析、酶促反应活性测定方法和FISH法分析方法都是染色体水平的检测，准确性较低；RALF、SSCP和MOLDI-TOF分析方法是间接检测方法，不能直接反映位点的变化；a-CGH、qPCR、MLPA只能针对特定位点，不能对新发现的突变位点进行解读，并且以上方法其测序通量很小，且要先经过PCR扩增过程。因此，虽然以Sanger法为基础的第一代测序技术是目前单基因病检测的金标准，但是由于同时测序的样本数很少，检测的单基因病种类有限，仅限于一种或几种，测序成本高昂，不能对多种已知分子基础的单基因病进行同时检测，大大限制了个体基因病的鉴定。

目前本领域尚缺乏有效的测定待检测样本中疾病相关核酸分子的核苷酸序列的方法。因此迫切需要针对已知的多种疾病的基因信息，开发新的检测个体化的样本中疾病相关核酸分子的核苷酸序列的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种测定待检测样本中疾病相关核酸分子的核苷酸序列的方法及其应用。

本发明的另一目的是提供一种测定待检测样本中疾病相关核酸分子的核苷酸序列的试剂盒。

在本发明的第一方面，提供了一种测定待检测样本中疾病相关核酸分子的核苷酸序列的方法，包括步骤：

a.提供一待检测样本，所述样品含有经打断的、源自基因组DNA的双链核酸片段，并且所述核酸片段具有平末端；

b.对于上一步骤的所述双链核酸片段，在末端添加接头连接序列；并且通过所述接头连接序列，在所述双链核酸片段的两端添加接头，其中所述接头具有引物结合区以及连接互补区，所述的连接互补区与所述的接头连接序列互补；

c.对步骤(b)获得的带有接头的DNA双链核酸片段，用第一引物和第二引物进行PCR扩增，从而获得第一PCR扩增产物的混合物，其中所述的第一引物和第二引物具有对应于所述接头的引物结合区的接头结合区，以及位于接头结合区外侧的测序探针结合区；

d.对所述的第一PCR扩增产物的混合物进行单链化，并用封闭分子封闭位于所述扩增产物两端的、对应于第一引物和第二引物的区域，从而获得两端被封闭的单链扩增产物的混合物；

e.用核酸芯片，从所述的经封闭的单链扩增产物的混合物中，捕获疾病相关的核酸分子；

f.对上一步骤中经捕获的核酸分子，用第三引物和第四引物进行PCR扩增，从而获得第二PCR扩增产物的混合物，其中第三引物和第四引物分别特异性对应于或结合于所述的第一引物和第二引物；

g.对上一步骤获得的第二PCR扩增产物的混合物进行测序，从而获得样本中疾病相关核酸分子的核苷酸序列。

在另一优选例中，步骤(g)中将所述的第二PCR扩增产物的混合物与固相载体上固定的测序探针进行杂交，并进行固相桥式PCR扩增，形成测序簇；然后对所述测序簇用“边合成-边测序”法进行测序，从而得到样本中疾病相关核酸分子的核苷酸序列。