[发明专利]乙型肝炎前C区和BCP区基因突变检测试剂盒、检测方法、引物及其探针

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种乙型肝炎前C区和BCP区基因突变检测试剂盒。

背景技术

乙型肝炎是严重威胁我国人民健康的病毒性传染病之一，我国约有2亿人口携带乙型肝炎病毒(HBV)，其中5％-10％慢性乙肝患者将有可能发展为肝硬化或肝癌。在HBV持续感染过程中，其基因组可出现各种变异，其变异率远远高于其它DNA病毒，这可能与其DNA聚合酶缺乏校正功能以及HBV承受宿主巨大的免疫压力有关。

HBV基因组前C区可出现nt1896位点变异，1896位核苷酸鸟嘌呤(G)→腺嘌呤(A)点突变使28位密码子上的色氨酸(UGG)变异为终止密码子(UAG)，从而使前C区启动的编码终止，病毒无法表达HBeAg，在血清学上表现为HBeAg阴性，而此时病毒复制并未停止。大量研究表明前C区变异株感染使变异病毒逃避了免疫清除，与慢性肝炎病人肝脏病变反复活动和暴发性肝炎的发生有关。

核心启动子(BCP)区是HBV前C区信使RNA(mRNA)转录的重要元件，对乙肝病毒的复制和转录起着重要的调控作用，在病毒复制、表达及致病等方面有着重大意义。同时BCP区也是突变发生的常见区域，以A1762T和G1764A双突变最为普遍。与野生株相比，变异株由于病毒复制水平提高，逃脱机体的免疫监视而具有更强的致病性，其结果一方面引起持续感染而不断诱导肝细胞炎性损害，降低肝脏功能贮备，并增加产生新的HBV基因突变的机会；另一方面突变病毒毒力的增强和抗原表位的改变，可以引起过度免疫应答反应，造成严重的肝细胞损伤，导致乙肝慢性化、重症化，甚至癌变。快速准确检测HBV BCP区突变对于乙肝的病程监控及癌变的早期诊断具有重要意义。

现有技术运用测序法检测HBV前C区/BCP区突变，具体方法如下：检测HBV前C区/BCP区突变可以通过对HBV BCP区基因进行PCR扩增，然后将PCR产物纯化后测序，具体如下：HBV前C区/BCP区扩增采用巢式PCR反应，在同一管内进行。第一轮引物：上游ATCCATACTGCGGAACTCCTAG(1264-1285)，下游GTAAAGTTTCCCACCTTATG(2466-2485)；第二轮引物：上游ACTTCGCTTCACCTCTGCAC(1583-1602)，下游CTGCGACG-CGGCGATTGAG(2403-2421)。基因扩增时在反应体系中加入高保真耐热DNA聚合酶，PCR产物经0.7％琼脂糖凝胶电泳鉴定和回收纯化后，用ABI3730型基因分析仪进行DNA序列测定。使用VectorNTI软件参照参考序列对测序结果BCP区进行比对，如果同一位点的变异与野生型峰图同时存在，且较低峰的高度超过较高峰高度的25％，则认为变异与野生型共存。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：现有技术对HBV基因组前C区/BCP区突变的检测无一例外都涉及PCR反应及PCR产物的后处理，后处理延长了检测时间，而且在处理过程中容易产生交叉污染，造成假阳性结果，同时处理过程中使用的某些毒性试剂会对检验人员的健康造成危害。测序法具有成本高，耗费时间长，不适用于大量样本检测的缺点。

发明内容

本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种免除PCR产物后处理步骤，操作简便，快速、准确地检测HBV基因组前C区/BCP区突变的试剂盒。

为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：一种乙型肝炎前C和区BCP区基因突变检测试剂盒，该试剂盒含有：

(1)PCR反应液：

其中包括DEPC处理水、具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×PCRBuffer、含有Mg2+离子的溶液、nt1896上游引物、nt1896下游引物、nt1896野生型探针、nt1896突变型探针、nt1762/1764上游引物、nt1762/1764下游引物、nt1762/1764野生型探针和nt1762/1764突变型探针；

①nt1896引物和探针

nt1896上游引物序列如序列表中SEQ ID NO.1所示：

5’CCTACTGTTCAAGCCT-CCAAGC 3’；

nt1896下游引物序列如序列表中SEQ ID NO.2所示：

5’AGCTCCAAATTCTTTATACGGGTC 3’；

nt1896野生型探针序列如序列表中SEQ ID NO.3所示：

5’TCC-ATGCCCCAAAGC 3’；