[发明专利]一种检测微囊藻毒素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及水污染物检测与治理领域，特别涉及一种检测微囊藻毒素的方法。

背景技术

微囊藻毒素是一种常见的水污染物，由在富营养化水体中大量繁殖的蓝藻产生。当蓝藻死亡，细胞破裂后，微囊藻毒素就会溶入水中，对水体周边人畜的生命安全造成危害。世界卫生组织规定，饮用水中微囊藻毒素-LR的含量不得超过1μg/L。一直以来，国内外关于微囊藻毒素引起的环境问题的报道屡见不鲜，太湖、巢湖等淡水湖几乎每年都要发生蓝藻爆发，居民生活用水被污染等严重的环境事件。因此，微囊藻毒素的痕量检测对于保障人民生命安全具有重要的意义。

目前广为应用的检测微囊藻毒素的方法，主要有毛细管电泳，高效液相色谱，液相色谱-质谱联用，气相色谱-质谱联用，拉曼检测，电化学方法以及一些生物方法，如酶联分析法，蛋白磷酸酶抑制分析法等。其中，液相色谱及色谱质谱联用的方法由于具有较高的分离效率与较好的检测灵敏度已在实际的微囊藻毒素检测中广泛应用，但是其样品前处理过程复杂，需要大型仪器，成本高，检测过程大都需要色谱，质谱等大型仪器，处理过程中需要引入一些有毒溶剂(乙腈等)，不利于实际水样的检测；电化学方法应用各种材料修饰电极实现对微囊藻毒素的间接检测，但多数需要用酶标记微囊藻毒素分子(不能保证产率)，通过竞争间接检测，降低了实际应用的范围；酶联分析法是目前常用的检测微囊藻毒素的方法，高商品化的试剂盒利用竞争方法，在具备微囊藻毒素单克隆抗体、标准纯毒素和有关试剂的前提下，根据加入的显色底物进行显色测定，是一种非常简便，高效，快速的方法，但是需要的抗体种类多，用量大，若对多种同系物进行识别则需要广谱抗体。与酶联分析法相比，蛋白磷酸酶抑制分析法具有更高的灵敏性，能够对样品中所有微囊藻毒素同系物总量检测出来，但通常需要放射性同位素的标记，使后续处理比较困难，无法发展成为常规的环境监测方法。最近，拉曼光谱也被应用到微囊藻毒素的检测中，通过在疏水基底上浓缩样品中微囊藻毒素的浓度来实现快速检测，但是需要在样品预处理过程中运用固相萃取等步骤，前处理过程复杂，耗时长，需要专业人员操作，给实际应用带来一定不便。

荧光共振能量转移是一种高灵敏的分析技术，它是指当供体电子受到激发跃迁到外层轨道时，会与受体的电子相互作用，实现能量传递，导致受体电子被激发，而供体电子本身回到基态的过程。这一过程受到供体和受体之间距离的影响，一般在1～10nm范围内发生，距离的进一步增大会导致荧光共振能量转移减弱直至消失。因此供体和受体的选择十分重要。近年来石墨烯及其衍生物因其优越的性能如：导电性高，表面积大，易于生物分子修饰等，被广泛应用于各种传感器的制备中。在荧光共振能量转移的应用中，石墨烯氧化物在供体和受体两方面都发挥着很大的优势。作为受体，石墨烯氧化物可以接受来自量子点，各种荧光分子的激发电子，作为荧光的淬灭剂。典型的应用是检测DNA分子和DNA碱基的错配。作为供体，石墨烯在400nm的激发波长下可以提供激发态的电子，将能量转移到受体上，使本身的荧光淬灭。这一性质被应用于病原体，细菌的检测。

因此，提供一种基于石墨烯氧化物、利用荧光共振能量转移原理检测微囊藻毒素的方法，具有实际意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种检测微囊藻毒素的方法，该方法通过氧化石墨烯与金纳米粒子之间发生荧光共振能量转移导致的氧化石墨烯荧光淬灭来检测微囊藻毒素的含量，具有较高的灵敏度、专一性，检测限低于世界卫生组织标准，适用于微囊藻毒素的痕量检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测微囊藻毒素的方法，包括以下步骤：

获得氧化石墨烯；

获得带正电的基底；所述氧化石墨烯与所述基底通过静电力连接；

取微囊藻毒素抗体与所述氧化石墨烯共价连接，获得供体基底；

获得金纳米粒子；

取巯基修饰的单链DNA与所述金纳米粒子混合，获得单链DNA-金纳米复合物；所述单链DNA具有12～20个碱基；

取所述单链DNA-金纳米复合物与不同浓度的微囊藻毒素标准品混合，所述微囊藻毒素与所述单链DNA的小沟结合，获得标准品受体复合物，再与所述供体基底、所述单链DNA的互补链共同孵育，通过抗原抗体特异性反应，获得氧化石墨烯-微囊藻毒素抗体-微囊藻毒素-单链DNA-金纳米粒子复合物，所述氧化石墨烯与所述金纳米粒子发生荧光共振能量转移，通过荧光检测获得第一荧光淬灭强度；所述单链DNA的互补链与所述单链DNA特异性结合，消除所述单链DNA与所述氧化石墨烯的非特异性结合；