[发明专利]一种用金磁微粒纯化植物种子基因组DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取植物种子基因组DNA的方法。

背景技术

转基因技术自70年代问世以来，已在多种作物品种改良得到应用。利用该项技术，不仅在品种间，而且在不同科属种间可以进行性状转移；克服远缘杂交的不亲合性；改良作物品质；提高作物抗逆性；从而实现多种目标性状的转移。实践证明，该项技术在作物品种改良方面具有广阔的应用前景，是一种行之有效的育种新途径。在该技术实现过程中，对植物种子基因组DNA提取及纯化非常关键。

核酸纯化方法大体上可分为两种，一种是酚氯仿抽提液相纯化法，一种是固相纯化法。酚氯仿抽提法主要通过有机相-水相分配来除去杂质达到纯化核酸的目的。固相纯化法则通过核酸与固相介质的非特异可逆性结合，从而达到纯化核酸的目的，其结合方式主要包括吸附结合和离子交换结合。

传统的几种植物种子基因组DNA提取方法存在一些缺点。如CTAB法和SDS法需要酚氯仿反复抽提与离心，耗费大量的时间，人力、物力。此外，现有的植物种子基因组DNA纯化的文献报道基本上都是针对一种植物，如针对含多糖较高的植物如水稻、含脂质较多的植物如棉花籽或含蛋白较多的植物如黄豆等开发的有针对性的方法。因为不同植物的组织材料，由于其化学成分、组织结构等差异，在提取基因组DNA时需选择不同的方法或作一些特殊的处理，这为实验带来极大的不便。目前，从植物种子样本中纯化DNA的试剂盒还较少，其中又以离心柱法为其主流的手动操作方法，价格昂贵且步骤繁琐，不利于广大科研系统使用，纯化效果也不理想。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用磁性纳米复合材料进行简便、快速纯化多种植物种子基因组DNA的方法，以解决背景技术操作不便、成本较高、纯度低、纯化率低等问题。

本发明的技术方案：

一种用金磁微粒纯化植物种子基因组DNA的方法，包括以下步骤：

1)制备含有基因组DNA的样品裂解液

取植物种子样本，加入200～800μl含有质量体积比为2％～5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2％～5％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和体积分数为0.5％～2％β-巯基乙醇的裂解液；混匀后于水浴中充分裂解5～30min，再加入10～50μl的10mg/ml RNase溶液，得到含有基因组DNA的样品裂解液；(“质量体积比”的单位即g/ml，表示该溶质的质量与该种裂解液的体积的比)

2)用氯仿抽提后离心

用0.6ml～1.2ml氯仿在所述样品裂解液中进行样本抽提，然后8000rpm～13000rpm离心5min，得到含有基因组DNA的上清；

3)结合

取400～1000μg金磁微粒与含有基因组DNA的上清混合，在结合缓冲液的作用下，形成含有金磁微粒-基因组DNA复合物的溶液；

4)清洗

对含有金磁微粒-基因组DNA复合物的溶液进行磁性分离，弃去上清液，再加入清洗液混匀，磁性分离，弃上清，得到金磁微粒-基因组DNA复合物；

5)洗脱

将洗脱液与金磁微粒-基因组DNA复合物混匀，使基因组DNA从金磁微粒上转到洗脱液中，磁性分离直至上清澄清，收集上清液，所得上清液即为纯化得到的基因组DNA溶液。

上述步骤1)中所述裂解液含有质量体积比为2％～5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2％～5％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和体积分数为0.5％～2％β-巯基乙醇、0.005～0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5～2M NaCl和0.05～0.2MTris-HCl。

上述步骤3)中的结合缓冲液优选聚乙二醇与氯化钠的混合溶液，其中氯化钠的终浓度为1M～3M，聚乙二醇(PEG)的分子量在6000～10000之间，浓度为10％～30％；也可以采用公知的其他结合缓冲液。

上述步骤5)中所述洗脱液优选含有10mM Tris-HCl和1mM EDTA、pH＝8.0的TE溶液或无核酶水。

上述步骤2)采用氯仿只需进行一次样本抽提。

上述步骤4)中所述清洗液是50％～85％的乙醇。

上述步骤1)中所述水浴的最佳温度为50～65℃。

本发明的优点：

1、本发明采用的裂解液，适用于所有植物种子。

2、得到的基因组DNA不含有抑制下游PCR反应的抑制剂；DNA质量高、得率高，DNA完整性好。

3、不需要反复抽提与离心，减少了机械使用中的物理性剪切，亦避免了离心过程对基因组DNA的破坏。