[发明专利]FGF-21活性测定的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体的说，本发明提供了成纤维生长因子-21(FGF-21)的葡糖糖摄取激活活性的体外测定方法。

背景技术

成纤维生长因子-21(Fibroblast Growth Factor-21，简称为FGF-21)是一种不依赖胰岛素调节血糖的代谢调节因子，作为一个有效的葡糖糖摄取激活剂。

体内检测方法(包括用动物模型进行检测)成本高，必要时还需要经过人道审批，因此体外测定是FGF-21葡糖糖摄取激活活性的最主要前期检测方式。有文献报道，进行FGF-21活性检测时使用[³H]或[¹⁴C]等放射性元素作标记，获得检测结果，进行分析。这样，监测仪器的要求和放射性物质的善后工作非常复杂和繁琐，不适合作为生产中批产品的常规活性监测方法。

例如，中国专利申请200480035794记载了用[¹⁴C]标记的葡萄糖进行累积测定FGF-21活性的方法；中国专利申请200580029480记载了用[¹⁴C]标记的葡萄糖进行累积测定FGF-21活性的方法，并利用成本更高的小鼠肥胖症动物模型来进行体内测定；中国专利200810223501记载了用[¹⁴C]标记的葡萄糖测定人重组FGF-21针对葡萄糖的活性的方法；中国专利申请20080009653记载了用[³H]标记的葡萄糖进行测定FGF-21活性的方法；中国专利申请200910104653记载了用[¹⁴C]标记的葡萄糖测定Exendin-4与FGF-21的融合蛋白针对葡萄糖的活性的方法。

另外，由于FGF-21具有刺激细胞增殖的作用，因此有部分方法通过测定细胞增殖的程度来推算葡糖糖摄取激活活性。但是，这种方法的最大缺陷是没有直接检测葡萄糖摄取激活的活性，定性推测结果还差强人意，定性推算的结果就误差较大了。

例如，中国专利200810102542公开了用MTT法测定BaF3细胞增殖，从而表征FGF-21生物活性的方法；中国专利申请200880017036公开了测定内皮细胞增殖来表征FGF-21生物活性的方法；中国专利申请200980130476公开了ELK-用萤光素酶测定法针对293T肾细胞测定FGF-21的生物活性。

本发明根据长期研究和实践，从大量的现有细胞系中，令人意外地发现了HL-7702人肝细胞和L6大鼠成肌细胞，基于它们进行非放射性直接检测FGF-21的葡糖糖摄取激活活性，结果在一定范围内使得FGF-21标准品的浓度对数值与葡糖糖摄取量呈现出良好的线性关系，可以用于体外检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供新的成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)的葡糖糖摄取激活活性的体外测定方法。

具体而言，本发明提供了成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)的葡糖糖摄取激活活性的体外测定方法，其依次包括：

(a)培养HL-7702人肝细胞或者L6大鼠肌肉细胞；

(b)任选使细胞分化；

(c)细胞饥饿处理；

(d)加入含FGF-21的培养基进行培养；和

(e)检测培养基中的葡萄糖含量，优选所述检测不是放射性检测。

尽管现有大量的细胞系，但是经测试，大量的细胞系在进行上述检测方法中，难以得到良好的线性关系的结果，这可能是各种细胞的代谢水平的差异化所决定的。由于大量细胞系中与FGF-21和葡萄糖代谢相关的细节并未很好地被揭示，因此难以形成规律化的指导。本发明人经过艰苦研究，从大量细胞系中获得了HL-7702人肝细胞和L6大鼠肌肉细胞，发现它们适于以上的方法中。

优选在本发明中，步骤(a)中的培养所使用的培养基是完全培养基。在本发明的具体实施方式中，本发明人优化了针对HL-7702人肝细胞和L6大鼠肌肉细胞的完全培养基。

优选在本发明中，步骤(b)中的分化所使用的培养基是分化液。在本发明的具体实施方式中，本发明人优化了针对HL-7702人肝细胞和L6大鼠肌肉细胞的分化液。

优选在本发明中，步骤(c)中的饥饿处理所使用的培养基是饥饿培养基。在本发明的具体实施方式中，本发明人优化了针对HL-7702人肝细胞和L6大鼠肌肉细胞的饥饿培养基。

优选在本发明中，步骤(d)中的培养基是饥饿培养基。在本发明的具体实施方式中，本发明人优化了针对HL-7702人肝细胞和L6大鼠肌肉细胞的饥饿培养基。