[发明专利]一种桑黄菌丝体的制备方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及生物技术，具体说就是一种桑黄菌丝体的制备方法。 

(二)背景技术

桑黄属担子菌亚门(Basidiomycotas)、层菌纲(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、锈革孔菌科(Hymenochae taceae)、针层孔菌属(Phellinus Quel.)。学名Phellinus baummi，中文名鲍姆层孔菌，因其子实体颜色鲜黄而俗称为桑黄，又称桑耳，是多年生的珍稀药用真菌。桑黄是目前国际公认的抗肿瘤最好的大型真菌之一，无任何毒性作用，是一种极具开发价值的珍贵药用真菌，成为药用真菌的研究热点。 

对于桑黄总RNA的高质量提取，是深入研究桑黄抗癌功效分子机制的基础，但目前国内外学者对此内容研究较少。在现有生产技术和文献报道中，常用提取某种丝状真菌总RNA的方法是将丝状真菌进行液体培养并收集菌丝体，然后液氮研磨，提取总RNA。所以要想获得高质量总RNA关键是如何获得高质量的菌丝体。关于丝状真菌菌丝体的液体培养，目前培养方法主要是从原种斜面上切取豆粒大小的一块菌饼接种入新配制并灭菌的液体培养基中，置于摇床中在合适的温度下振荡培养。通过此种方法培养后收集得到的菌丝体，由于附带固体培养基，所以导致提取的总RNA浓度不高，直接影响后续的深入研究。因此，需要寻求一种更合适的获得桑黄菌丝体的方法以获取高质量总RNA。 

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种桑黄菌丝体的制备方法。 

本发明的目的是这样实现的：步骤如下： 

步骤一：桑黄菌种活化： 

将保存在冰箱里的桑黄菌种用马铃薯葡萄糖琼脂培养基试管斜面活化，首先将从4℃冰箱里拿出来的桑黄菌种在室温下放置一段时间，达到与室温一致即可，然后在超净工作台内进行马铃薯葡萄糖琼脂培养基试管斜面接种，每个试管斜面只接一个点，盖上胶塞，放置在 25℃温箱里恒温避光培养5-7天； 

步骤二：马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板培养： 

将已活化的桑黄菌种转接到马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，在超净工作台内，用接种钩挑取马铃薯葡萄糖琼脂培养基试管斜面上边缘生长旺盛的桑黄菌丝体，接于平板中间，每个平板只接一个点，用封口膜封上置于25℃温箱里恒温避光培养7-9天； 

步骤三：刮取桑黄菌丝体接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中进行振荡培养： 

将要长满平板的年轻桑黄菌丝体进行刮取并接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，首先，要选择几乎长满平板但还没有老化变黄的桑黄菌丝体作为接种材料，因为这样的菌丝体更易于刮取；用灭过菌的小钥匙进行刮取，刮的时候不要太用力，只刮取桑黄菌丝体，不要连带培养基，刮取下来的桑黄菌丝体在马铃薯葡萄糖液体培养基里以涮的方式进行接种，接入250ml三角瓶中，每瓶接入1-2个平板的桑黄菌丝体；封瓶膜封口后，置于恒温振荡器120r/min，25℃恒温避光振荡培养5-7天； 

步骤四：收集桑黄菌丝体： 

在马铃薯葡萄糖液体培养基尚未变色之前进行桑黄菌丝体收集，将三角瓶里的桑黄菌丝体，进行10层纱布过滤，用无菌蒸馏水冲洗桑黄菌丝体2-3遍，冲掉残留的马铃薯葡萄糖液体培养基，带上一次性手套将纱布拧干，拧到桑黄菌丝体在纱布上略微粘起的程度即可，用灭过菌的镊子将桑黄菌丝体从纱布上小块地撕取下来，放入2mL的离心管中，不要放得太实，装入量为离心管的1/3即可，置于-70℃保存，备用； 

步骤五：提取桑黄菌丝体总RNA