[发明专利]微量核酸样本的文库制备方法及其应用

权利要求书

1.一种制备核酸文库的方法，其特征在于，包括步骤：

a.提供一待测样本，所述样本含有的核酸总量为2皮克～1微克；

b.对待测样本进行DOP-PCR扩增，获得第一PCR扩增产物；

c.用DOP-Amp引物对第一PCR扩增产物进行第二次PCR扩增，获得第二PCR扩增产物；

d.对获得的第二PCR扩增产物进行接头连接PCR，获得第三PCR扩增产物，即为核酸文库；

较佳地，所述的第三PCR扩增产物的5′端具有接头，且3′端具有接头。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤(e)：

对第三PCR扩增产物依据片段大小进行选择。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述的样本选自下组：

1-200个单细胞构成的样本，或

含有1-200个单细胞的核酸样本，或

核酸总含量为2皮克～1微克的核酸样本；

较佳地，所述样本选自下组：微量基因组DNA、免疫共沉淀产物DNA、游离DNA、cDNA、或其组合；

或所述DNA具有选自下组的一个或多个特征：

所述DNA来自环境，更佳地，来自土壤和/或水体；

所述DNA来自体液或排泄物；

所述DNA来自来自血浆和/或尿液；

所述DNA经化学或物理方法处理；

所述DNA经亚硫酸氢盐处理。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)使用带有简并寡核苷酸区的DOP引物对样本DNA进行随机扩增；

所述的DOP引物具有选自下组的一个或多个特征：

所述的DOP引物具有位于5′端的非简并寡核苷酸区和位于中部的简并寡核苷酸区和3′端的锚定区；

所述的DOP引物具有位于5′端的非简并寡核苷酸区和位于中部和3′端的简并寡核苷酸区；

所述DOP引物的3′端锚定区的序列长度为2-12个核苷酸；

所述DOP引物的3′端锚定区的序列长度为4-8个核苷酸；

所述DOP引物的3′端锚定区任选自下组：TG、ATGTGG、TGTGG，或GTCT；

所述DOP引物的5′端非简并寡核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述DOP引物的5′端非简并寡核苷酸序列与SEQ ID NO：2所示序列的同源性≥50％；

所述的DOP引物的5′端非简并寡核苷酸长度为5-30bp，较佳地5-20bp，更佳地6-13bp；

所述的简并寡核苷酸序列如(N)m所示，其中每个碱基位置上的N包括A、T、G和C，m为3-20的正整数。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)所述的DOP-Amp引物与步骤(b)所述的5’端非简并寡核苷酸互补或基本上互补；

较佳地，DOP-Amp引物序列结合于DOP引物5’端非简并寡核苷酸区；

或较佳地，DOP-Amp引物序列如SEQ ID NO：2所示。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)用接头引物进行接头连接PCR扩增；

较佳地，所述的接头引物为P5和P7，且P5和P7的3’端都具有可结合于DOP-Amp引物序列的非简并寡核苷酸区，所述的非简并寡核苷酸区的序列与SEQID NO：2所示序列相同或完全互补，或者与SEQ ID NO：2所示序列有≥80％的同源性；

或优选地，所述的接头引物P7具有标签序列。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(e)中所述的依据片段大小进行选择为：在第三PCR扩增产物中选择100-1000bp长度的片段；

较佳地，所述的依据片段大小进行选择为：在第三PCR扩增产物中选择200-500bp长度的片段。

8.一种检测微量核酸样本中核苷酸序列的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)对于所提供的单细胞及微量核酸样本，用权利要求1-7任一所述的方法制备所述样本的核酸文库；

(ii)对所述核酸文库中的片段进行测序和数据分析；

较佳地，所述的测序为第二代高通量测序法；更佳地，所述第二代高通量测序法选自下组：Roche454 FLX、Illumina Solexa或ABI SOLID测序平台。