[发明专利]一种检测甘蔗宿根矮化病菌的实时荧光定量PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及甘蔗健康种苗与甘蔗抗性鉴定分子生物学技术领域，特别是甘蔗宿根矮化病菌的检测引物和定量PCR检测方法。

背景技术

甘蔗宿根矮化病（ratoon stuning disease, RSD）是世界各甘蔗种植区普遍发生的一种细菌性病害。该病是由一种棒杆细菌Leifsonia xyli subsp.xyli寄生于蔗株的维管束中引起，主要通过带病蔗种和收获时砍种刀具相互传播，在一定时期内，部分通过土壤传播。Davis等研究表明，该菌不易分离培养，为革兰氏阳性杆状细菌，由于该病没有明显的外部和内部症状，仅仅从外观上难以鉴定，特别严重时才会表现蔗株矮化、纤细、分蘖减少、生长慢等症状，且蔗株矮化会随甘蔗宿根年限的延长而加重。甘蔗宿根矮化病一般造成减产10%-30%，干旱缺水时可达60%以上，而且还能导致品种种性退化。近年来，随着国内外甘蔗育种单位之间的相互引种、国内各蔗区间的频繁调种以及农业机械化的推进，RSD迅速蔓延。

目前，由于甘蔗宿根矮化病菌尚没有有效化学防治方法，同时缺乏抗性材料，甘蔗抗RSD育种进程缓慢。当前最有效的控制手段就是普及种植甘蔗健康种苗，甘蔗健康种苗的主要目的就是去除甘蔗易受感染的病毒病与细菌性病害，其中包括甘蔗宿根矮化病。如何快速准确的鉴定甘蔗健康种苗是否含有RSD菌是目前甘蔗健康种苗生产必备的关键技术。目前，宿根矮化病的常规检测均是对甘蔗蔗汁直接进行检测，方法主要有显微镜技术、电视差显微镜技术、血清学技术和常规PCR等。但是前两种方法都存在需要样品量多、操作复杂、检测耗时长、灵敏度不高等缺点，在实际中很难应用；血清学技术虽然可以克服前两者所存在的缺点，实现高通量检测，但相对于定量PCR而言，检测灵敏度不高；而常规PCR技术只能终点定量，无法对病原菌初始浓度进行准确定量。因此，为了保证国家的甘蔗健康种苗生产计划的顺利进行，提高我国甘蔗生产技术水平，迫切需要建立一种简便、快速、准确、灵敏的检测宿根矮化病菌的实时荧光定量PCR方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有检测宿根矮化病病菌方法中不能定量病原菌数量、准确性差、且费时、费力的问题，而提供了一种检测甘蔗宿根矮化病菌的实时荧光定量PCR方法。

本发明的技术方案如下：

本发明首先提供了一种利用实时荧光定量PCR方法检测甘蔗宿根矮化病菌的引物及探针，所述的引物为以下序列的引物对：正向引物序列5’-GGTTCCATTGCTTACCGATT-3’，反向引物序列5’-CAAGTTTCGACAGGAACAGC-3’，探针序列是FAM-5-CCACGGCTACGTCAATTCGGG-3-TAMRA。

本发明还提供了一种检测甘蔗宿根矮化病病菌的实时荧光定量PCR方法，包括以下步骤：

（1）宿根矮化病病菌的Pat1基因片段的克隆及标准曲线绘制：以宿根矮化病致病菌DNA为模板，采用所述引物对进行PCR扩增，切胶纯化，连接到PMD18-T载体上，选择阳性克隆，提取质粒DNA，得到宿根矮化病菌的Pat1基因，测定质粒DNA的吸光值，并将吸光值转化成质粒DNA的浓度，再将质粒DNA的浓度转化成为拷贝数，进行梯度稀释，并以稀释后的质粒DNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线，构建标准曲线方程；

（2）以待测样品蔗汁DNA为模板，用所述引物与探针进行实时荧光定量PCR扩增，通过将产生的的Ct值代入标准曲线方程转化成起始反应的DNA分子拷贝数，即一个分子拷贝数代表一个白条病菌，从而定量检测甘蔗样品中感染宿根矮化病菌的数量。

所述实时荧光定量PCR扩增的反应体系为25 μL：2×TaqMan Universal Master Mix 12.5 μL；10 μmol/L正向引物与反向引物各0.75 μL；10 μmol/L探针0.4 μL；DNA模板1.0 μL；补水至25 μL。

所述实时荧光定量PCR扩增的反应条件为：50 ℃，2 min，预变性95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，退火延伸，1 min，40个循环，在60℃进行单点荧光检测。

为了保证定量检测的准确性，因此在设计引物与探针时选择该病原菌所特异致病基因Pat1，然后将该序列在NCBI进行序列比对，该基因为宿根矮化病菌所特异性基因，与其他生物基因没有显著的同源性。