[发明专利]一种构建基因工程FK506高产菌株的方法和筑波链霉菌高产菌株

权利要求书

1.一种稳定高产FK506即他克莫司的工程菌株，其特征在于，所述菌株的基因组中整合有基因倍增表达盒，所述的基因倍增表达盒表达烯丙基丙二酰-CoA合成基因所编码的蛋白，其中所述的基因倍增表达盒中含有的倍增目的基因为tcsABCD；并且，所述菌株为筑波链霉菌Streptomyces tsukubaensis。

2.如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述菌株的基因组中整合有1-20个所述的基因倍增表达盒。

3.如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述的基因组中整合有1-10个所述的基因倍增表达盒。

4.如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述的基因组中整合有2个所述的基因倍增表达盒。

5.如权利要求1-4中任一所述的工程菌株，其特征在于，所述基因倍增表达盒还表达甲氧基丙二酰-ACP合成基因编码的蛋白，其中所述的甲氧基丙二酰-ACP合成基因为fkbGKJIH。

6.一种生产FK506即他克莫司的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)培养权利要求1所述的工程菌株，从而获得含FK506的发酵产物；和

(ii)从所述发酵产物中分离出FK506。

7.一种构建权利要求1所述菌株的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)构建含有基因倍增表达盒的载体，所述表达盒具有以下元件：

ΦC31整合酶基因，噬菌体附着位点靶序列attP，属间接合元件oriT，阿泊拉霉素抗性基因acc(3)IV，和倍增目的基因，其中所述倍增目的基因为tcsABCD；

(b)将步骤(a)获得的含有基因倍增表达盒的载体转入受体菌株，获得受体基因组整合有基因倍增表达盒的菌株。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括步骤(c)：PCR验证步骤(b)得到的整合有基因倍增表达盒的菌株的基因型；和/或

步骤(d)：发酵检测得到的整合有基因倍增表达盒菌株的FK506即他克莫司的产量。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述的载体为质粒、黏粒或核酸片段。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述表达盒还含有强启动子元件。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的强启动子元件为红霉素抗性基因ermE的启动子ermE*。

12.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的受体菌株为筑波链霉菌Streptomyces tsukubaensis ZJU506-01，保藏号为CGMCC No.5177。

13.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(b)所述受体基因组整合的基因倍增表达盒数量为1-5个。

14.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(b)所述受体基因组整合的基因倍增表达盒数量为2个。

15.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(b)所述的受体菌株具有附着位点attB。

16.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(b)所述的整合为载体attP位点和受体基因组attB位点之间的位点特异性整合。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述attP位点和attB位点之间整合后形成重组杂合位点attL和attR。

18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述attL的核心核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述attR的核心核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述attL的核心核苷酸序列与SEQ ID NO：1序列的同源性为70-100％，所述attR的核心核苷酸序列与SEQ ID NO：2序列的同源性为70-100％。

20.一种权利要求1所述工程菌株的用途，其特征在于，它被用作发酵生产FK506即他克莫司及其衍生物的工程菌。