[发明专利]多菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及采用细胞固定化技术连续制醋的方法。

背景技术

食醋是我国传统的重要酿造调味品，大多数生产企业均采用传统固态发酵法酿造食醋，固态发酵工艺的产品风味、口感、品质较好，但存在卫生条件差、原料利用率较低、劳动强度大等缺点，生产工艺中淀粉转化率、糖酸转化率、产酸率均相对较低。

与传统的发酵技术相比较，细胞固定化发酵具有以下特出优点：

① 方法简便，将细胞与单体或聚合物一起聚凝，细胞被包埋在形成的聚合物之中；② 条件温和，可选用不同的聚合物载体，不同的包埋系统和条件，以保持细胞的酶催化活性；③ 细胞不易渗漏，稳定性好；④ 细胞密度高，有较高的细胞容量，聚合体中的细胞含量可达50%～70%；⑤ 固定化的细胞可以多批次使用。

现有的细胞固定化技术在理论方面研究的多、生产实践中用的少；很多研究也是局限于单一菌种的固定化。食醋酿造工艺涉及3种主要的微生物类群和相关技术过程：黑曲霉将淀粉转化为糖类，酵母菌将糖转化为酒精，醋酸杆菌将酒精转化为醋酸。在食醋酿造行业只有零星的研究涉及醋酸杆菌细胞固定化，这不能改变传统食醋酿造的面貌。因为采用固定化醋酸杆菌进行醋酸发酵，还需要采用传统的工艺将粮食等淀粉类原材料转化为糖类，再采用酵母菌将糖类转化为酒精，只有获得酒精，才能进入固定化醋酸杆菌发酵阶段。因此将食醋酿造相关微生物分别固定化，进而构建固定化细胞连续发酵技术，为酿造行业提供先进的发酵技术，将会改变食醋行业的生产面貌，提高企业生产效率，扩大生产规模，增加企业的经济效益，促进酿造行业的技术进步。

发明内容

为改变传统食醋酿造的落后面貌，采用细胞固定化技术将食醋酿造相关微生物菌株固定，构建固定化细胞发酵器，将固定化细胞发酵器串联形成固定化细胞连续发酵技术。

具体操作方法如下：

1、二个菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法，具体操作步骤如下：

1.1、菌株培养

所用菌株为A菌株和B菌株；

A菌株为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1001菌株，可将糖类转化为酒精；

B菌株为巴氏醋杆菌巴氏亚种Acetobacter pasteurianus subsp. pasteurianus 7015菌株，可将酒精转化为醋酸；

1.1.1、A菌株的培养，将酿酒酵母斜面菌种接种至酿酒酵母培养基，温度30℃、转速80～150转/分钟，培养24～48h，使酿酒酵母培养基中的酵母细胞浓度达到5.0×10⁷/mL～1.0×10⁹/mL，得到A菌株菌液；

酿酒酵母培养基配方：5°Bé麦芽汁，121℃高压灭菌20分钟；

1.1.2、B菌株的培养，将巴氏醋杆菌巴氏亚种斜面菌种接种至醋杆菌培养基，温度30℃、转速80~150转/分钟，培养24~48h，使醋杆菌培养基中的巴氏醋杆菌细胞浓度达到5.0×10⁷/mL～5.0×10⁹/mL，得到B菌株菌液；

醋杆菌培养基配方：3°Bé麦芽汁，硫酸镁0.2%，酵母膏0.5%，磷酸二氢钾0.3%，葡萄糖2%， 121℃高压灭菌20分钟，灭菌后加95%酒精2～3%混匀；

1.2、菌株的固定化

1.2.1、细胞的离心洗涤：取A菌株菌液50mL、B菌株菌液50mL，分别在转速为5000～10000转/分钟条件下，离心分离10～15分钟，倾去上清液，用0.85%生理盐水悬浮细胞，完成一次细胞的离心洗涤；再重复2次细胞的离心洗涤，制得A菌株细胞悬液和B菌株细胞悬液；

1.2.2、取A菌株细胞悬液50mL和B菌株细胞悬液50mL，与浓度1％～5％的固定化载体溶液按体积比1: 1～4的比例混合均匀，成型造粒，固定化细胞颗粒直径2～5mm，室温固化2～6小时，置于4℃冰箱中，12小时平衡，倾去上清液，加入无菌水洗涤3次；分别制得A菌株固定化细胞颗粒和B菌株固定化细胞颗粒，置于冰箱中备用；

所述固定化载体溶液中载体为琼脂或壳聚糖或角叉或聚乙烯醇，溶剂为水；

1.3、固定化细胞连续发酵制醋