[发明专利]一种微囊藻毒素的快速提取检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及水质检测技术领域，更具体涉及一种水体中快速提取检测微囊藻毒素的方法，尤其适合因蓝藻水华污染的水体中浮游藻类的快速取样、提取和检测微囊蓝藻毒素。该发明能广泛应用于水体中的微囊藻毒素的现场快速检测中。

背景技术

蓝藻水华在国内暴发的频率和强度日益加重，随着水环境中微囊藻毒素含量的监测被列为饮用水源的安全标准(WHO 1998)，微囊藻毒素的常规检测日益引起世界各国的重视。因此有必要建立一种能在常规实验室推广应用的高效提取检测微囊藻毒素的技术。

在微囊藻毒素的提取和检测工作中，首先要解决微囊藻毒素的快速高效提取问题。据文献报道，毒素抽提的方法包括真空干燥处理、冻融或烘干、微波或沸水浴加热处理等。这些方法均有各自优缺点：真空干燥效果较好，但设备昂贵难以普及；烘干和加热的方法会导致一些对热敏感的毒素变体降解；而冻融方法存在细胞破碎率低、提取效率较低的缺点。

采用常规的微囊藻毒素提取方法，往往还需要磁力搅拌器搅拌反复抽提，并加上C₁₈ODS固相萃取柱浓缩、旋转蒸发器干燥定容的处理步骤。实验中发现，传统的提取方法，具有提取时间过长、工作量大、样品提取和预处理步骤复杂、被检测样品和使用试剂需要量较大等缺点，特别不适合进行现场实时监测和大量样品的处理和分析。因此有必要在目前相关研究的基础上，建立起一套微囊藻毒素的快速高效提取方法。

发明内容

本发明的目的是提供了一种微囊藻毒素的快速提取检测方法。该方法操作简单，高效快捷，所需仪器非常简单，普通实验室均可以操作；此外大大减轻了工作强度，适用于对大量的样品的批量处理；同时待测藻样需要量少，也减轻了藻样培养、环境样品的采集工作量。本发明能广泛应用于常规实验室进行大批量的毒素提取和分析工作。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种微囊藻毒素的快速提取检测方法，该方案按照以下步骤进行：

A.样品处理：采集野外的水华微囊藻样品，由于天然水体中往往存在大量有机杂物，且藻细胞中通常含有大量的伪空胞而无法用通常采用的离心方法浓缩收获，因此需采用有效的处理方法。本发明提出的样品浓缩纯化处理方法，是在Shen提出的方法(Shen，Fresenius Environmental Bulletin，2005年第14卷，1124-1128页)的基础上，在实验工作中进一步改进而得到的成熟方法。

B.匀浆、干重测定：经步骤A浓缩处理后的样品，通过采用匀浆处理破碎藻细胞团的方法(周湘池，海洋与湖沼，2006年第5期，424-429页)后，使藻浆密度均一化并测定干重。由于天然水体中的水华微囊藻往往以群体形态存在，为达到藻细胞团分散和藻浆密度均匀，以及保证干重称量的准确性及微囊藻毒素提取效率的目的，本处理步骤十分必要。

C.毒素一步法提取：采用50％-90％(V/V)甲醇溶液快速提取微囊藻毒素。微囊藻毒素类似于细胞内毒素，只有在藻细胞裂解破碎后才能被释放出来。因此选择能缩短提取时间、提高提取效率的微囊藻毒素提取方法和提取溶剂十分重要。本发明在当前国内外的相关研究的基础上(M Barco，Journal of Chromatography A，2005年第1074卷，23-30页)，通过大量反复实验，选择合理提取溶剂(50％-90％体积比甲醇)，优化待提取样品和提取溶剂比例(样品藻干重和甲醇提取液重量体积比1/30000-1/5000)、提高提取液的提取效率、优化提取步骤等手段，最后提出该快速提取样品微囊藻毒素的步骤，方法简单可靠。

D.离心、过滤：步骤C提取后的提取液，经HPLC检测前，需再经进一步的离心过滤的纯化处理步骤。提取液经过高速离心后取上清，然后再经0.45μm的微滤器过滤进一步纯化。本次离心过滤步骤可以除去大量的藻细胞碎片，以便于随后的HPLC仪器检测。

E.HPLC检测：选用高效的HPLC快速分析色谱柱，在优化后色谱条件下对样品进行检测分析。在该检测体系下，微囊藻毒素MC-RR、MC-LR的保留时间在3min以内。与传统的HPLC检测方法相比，在保证分离效果的前提下毒素分析时间被大大缩短。

本发明与现有的微囊藻毒素提取检测方法相比，有以下的优点和效果：

1.本提取方法采用的是甲醇一步法提取，与Harada在1988年提出的常规的毒素提取方法(Journal of Chromatography，第448卷，275-283页)相比较，避免了提取液的多次转移而造成的污染、损失等误差，充分保证了测定结果的准确性和可靠性。